納米碳酸鈣驅(qū)鉛效果研究*

朱軒儀，黃彥凝，巫放明，潘一峰，何剪太，肖平

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 2.腎內(nèi)科，3.普外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

納米碳酸鈣驅(qū)鉛效果研究*

朱軒儀1，黃彥凝2，巫放明1，潘一峰1，何剪太3，肖平2

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 2.腎內(nèi)科，3.普外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

目的探討納米碳酸鈣的驅(qū)鉛效果。方法實(shí)驗(yàn)藥物納米碳酸鈣（40～80 nm），采用超重力反應(yīng)沉淀法復(fù)制。4周齡大鼠連續(xù)14 d飲用醋酸鉛溶液被復(fù)制成重度鉛中毒模型（血鉛濃度達(dá)到>500 μg/L）。原子吸收光譜法檢測(cè)大鼠血鉛濃度。結(jié)果給藥22 d后，納米碳酸鈣40～80 nm組的血鉛平均濃度為（117±7）μg/L，接近正常血鉛水平，低于對(duì)照組的平均血鉛濃度（297±33）μg/L（P<0.05）。結(jié)論納米碳酸鈣（40～80 nm）具有較好的驅(qū)鉛效果，優(yōu)于自然排鉛。

鉛中毒；納米碳酸鈣；驅(qū)鉛效果；自然排鉛

Abstract:ObjectiveTo evaluate the therapeutic effects of calcium carbonate nanoparticle.MethodsCalcium carbonate nanoparticle with 40～80 nanometers was prepared by high gravity reaction precipitation.The severe level of lead-poisoning model(estimated blood lead concentration of 500 μg/L or above)was made in 4 weeks old rats through 14 days consecutively drinking lead acetate solution.The drug efficacy was estimated by the concentration of blood lead.ResultsAfter three weeks of drug administration,the average concentration of blood lead in calcium carbonate nanoparticle group was(117±7)μg/L,which was closed to the normal blood lead,and was lower than that of the untreated group(P<0.05).The mean level of blood lead concentration of untreated group was(297 ± 33)μg/L,which was a moderate lead poisoning level.ConclusionsCalcium carbonate nanoparticle with size from 40 to 80 nm displays high efficiency of lead-out effect and is better than natural lead removal.

Keywords:lead poisoning;nano calcium carbonate;flooding lead effect;natural lead removal

鉛中毒是一種嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)并累及多種重要器官的重金屬中毒疾病[1-3]。鉛在日常生活中廣泛存在，并能通過(guò)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)甚至皮膚等多種途徑進(jìn)入人體[4]，極易成為一種常見(jiàn)疾病。常用驅(qū)鉛藥物的主要成分是絡(luò)合劑，在臨床使用中證明有良好的驅(qū)鉛效果，其機(jī)制是絡(luò)合劑經(jīng)血液循環(huán)分布到各個(gè)器官，通過(guò)絡(luò)合反應(yīng)與鉛元素形成重金屬絡(luò)合物，并通過(guò)腎臟經(jīng)由尿液排鉛，但其副作用也十分明顯，除頭暈、惡心等癥狀，還會(huì)對(duì)腎臟造成額外負(fù)擔(dān)，長(zhǎng)期使用損傷腎臟功能[5]。自然排鉛有兩種途徑：①通過(guò)腎臟排鉛，這也是主要的排鉛方式；②通過(guò)肝臟（膽汁）排鉛，由于肝細(xì)胞對(duì)鉛元素有通透作用，能從血漿攝入鉛并排入膽汁中，所以膽汁的鉛含量是全血的40～100倍[6]，然而該方式排鉛量較少，其原因是肝腸循環(huán)將由膽汁排入腸的鉛在腸道重吸收，通過(guò)門(mén)靜脈再次返回肝臟[7]。

游離態(tài)的鉛元素在腸道中主要以磷酸氫鉛（lead hydrogen phosphate,PbHPO4）形式存在，其沉淀平衡常數(shù)（solubility product，Ksp） 為 1.3×10-10，碳酸鈣（calcium carbonate，CaCO3）的 Ksp 為 4.5×10-9，碳酸鉛（lead carbonate，PbCO3）的 Ksp 為 3.3×10-14，實(shí)驗(yàn)證明，PbHPO4能與CaCO3發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀平衡常數(shù)更小的PbCO3[8]。本實(shí)驗(yàn)利用納米碳酸鈣在腸道與鉛離子結(jié)合產(chǎn)生沉淀，阻斷肝腸循環(huán)中鉛元素在腸道的重吸收，從而增加腸道中鉛通過(guò)糞便排出的量，達(dá)到驅(qū)鉛效果。

1 材料與方法

1.1 藥品

納米碳酸鈣40～80 nm（購(gòu)自山西省運(yùn)城新泰恒信納米材料有限公司）。

1.2 試劑和耗材

三水合醋酸鉛（乙酸鉛）分析純（analytical reagent，AR）（購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），肝素鋰管（購(gòu)自廣東省深圳衛(wèi)麗寶商貿(mào)有限公司）。

1.3 儀器

BH2101S型原子吸收光譜儀（購(gòu)自北京博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司），EM SCD 500高真空鍍膜儀（購(gòu)自上海Leica公司），Nova Nano SEM 230掃描電子顯微鏡（購(gòu)自美國(guó)FEI公司），HYQ-3111渦旋混勻器（購(gòu)自Crystal美國(guó)精騏有限公司）。

1.4 動(dòng)物模型驅(qū)鉛實(shí)驗(yàn)

1.4.1 復(fù)制鉛中毒模型 用超純水配制0.6%醋酸鉛溶液，高溫滅菌并冷卻后，代替飲用水，喂養(yǎng)動(dòng)物14 d，測(cè)量血鉛濃度確認(rèn)>500 μg/L。復(fù)制成功后，停止喂鉛，實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始給藥。

1.4.2 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SD（sprague-dawley）大鼠，無(wú)特定病原體級(jí)（specific pathogen free，SPF），雄性，4周齡，購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，于中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。動(dòng)物總數(shù)23只，分為兩組，分別是納米碳酸鈣組（實(shí)驗(yàn)組n=11）和（鉛中毒+不給藥組）（對(duì)照組n=12）。

1.4.3 給藥劑量 實(shí)驗(yàn)組給藥劑量：每天灌胃給藥，1次 /d，劑量：500 mg/kg（藥量 /大鼠體重，下同）。

1.5 全血樣品采集和保存

鉛中毒14 d后，給藥前（第0天），從大鼠尾靜脈中抽取0.3 ml血樣，立刻加入肝素鋰管中，震蕩搖勻，確保血樣不會(huì)凝固，置入4℃冰箱保存，作為鉛中毒治療前的全血樣本。之后，開(kāi)始每天喂藥治療，在下列時(shí)間點(diǎn)取血樣本0.3 ml，治療的第2、4、6、8、10、12、14、18 及 22 天，在喂藥前取血樣本。

1.6 血鉛指標(biāo)的測(cè)定和鉛中毒水平判斷標(biāo)準(zhǔn)

通過(guò)原子吸收光譜法檢測(cè)血液中的鉛濃度。用毛細(xì)管吸取40μl大鼠尾靜脈血，加入原子吸收光譜儀人體元素專用檢測(cè)試劑（體積=0.36 ml），充分震蕩混勻，在BH2101S型原子吸收光譜儀的標(biāo)準(zhǔn)工作狀態(tài)下，在鎢舟片上滴加50 μl稀釋液，測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到稀釋液鉛濃度，再乘以10倍的稀釋倍數(shù)，得到血鉛含量。

鉛中毒程度分為輕、中和重等級(jí)，以血鉛濃度作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。輕度鉛中毒水平為100～200 μg/L，中度為 200～500 μg/L，重度為 >500 μg/L。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

給藥實(shí)驗(yàn)前，測(cè)量?jī)山M的血鉛含量均達(dá)到重度鉛中毒水平。給藥6 d后，對(duì)照組的血鉛濃度為（526±97）μg/L，同第0天比較，下降約41%，屬于重度鉛中毒水平。而實(shí)驗(yàn)組的血鉛濃度分別為（315±55）μg/L，同第0天比較，下降約65%，達(dá)到中度鉛中毒水平，并低于對(duì)照組（P<0.05）。在給藥第8～10天，雖然各組均表現(xiàn)出血鉛升高的趨勢(shì)，但在第10天，對(duì)照組血鉛濃度為（503±116）μg/L，屬于重度鉛中毒水平，實(shí)驗(yàn)組的血鉛濃度為（284±48）μg/L，屬于中度鉛中毒水平，低于對(duì)照組。在給藥22 d后，對(duì)照組的血鉛濃度下降到（297±33）μg/L，約減小70%的血鉛含量，仍屬中度鉛中毒水平。而實(shí)驗(yàn)組的血鉛濃度為（117±7）μg/L，接近正常水平（≈100μg/L），相對(duì)于治療前，血鉛含量分別下降約87%，低于對(duì)照組（P<0.05）。在給藥過(guò)程中，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組血鉛回升情況較弱，且血鉛濃度下降趨勢(shì)更為穩(wěn)定快速。治療第4天，對(duì)照組的血鉛濃度為（556±74）μg/L，下降38%，實(shí)驗(yàn)組的血鉛濃度為（381±49）μg/L，降低約58%，低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)附表和附圖。

附表 兩組不同時(shí)間給藥后血鉛含量比較 （μg/L，±s）

附表 兩組不同時(shí)間給藥后血鉛含量比較 （μg/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，P<0.05

組別 第0天 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天 第12天 第14天 第18天 第22天實(shí)驗(yàn)組（n=11） 930±101 444±65 381±49 315±55 228±33 284±48 224±28 245±35 237±100 117±7對(duì)照組（n=12） 905±73 510±60 556±74 526±97 269±45 503±116 220±29 296±40 177±28 297±33Z值 -0.369 -0.646 -2.063 -1.929 -0.739 -1.260 -0.369 -0.571 -0.149 -2.236P值 0.370 0.268 0.040 0.027 0.238 0.117 0.370 0.314 0.500 0.018

附圖 兩組血鉛變化情況

3 討論

根據(jù)國(guó)際統(tǒng)一使用1991年美國(guó)國(guó)家疾控控制中心制定的兒童鉛中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)血鉛含量達(dá)到重度鉛中毒水平（>500 μg/L）時(shí)，必須進(jìn)行鉛中毒藥物治療，否則僅需要通過(guò)驅(qū)鉛食物進(jìn)行驅(qū)鉛治療。

2015年LEE證明納米碳酸鈣懸濁液在經(jīng)過(guò)SD大鼠胃部時(shí)僅有4%反應(yīng)，并具備良好的生物安全性[10]，所以本實(shí)驗(yàn)將納米碳酸鈣制成懸濁液灌胃給藥。其主要晶體形態(tài)為球霰石型，具有較大的比表面積、較高的溶解性和分散性以及較小的比重[11]，有利于其在腸道中與鉛有更快的反應(yīng)速度。

給藥22d后，實(shí)驗(yàn)組的血鉛含量低于對(duì)照組。在給藥過(guò)程中，兩組血鉛均有不同程度的回升，其中對(duì)照組血鉛下降趨勢(shì)較弱，且血鉛回升情況更為明顯，其主要原因是在無(wú)外源性鉛攝入時(shí)，骨骼由于鉛中毒過(guò)程中的鉛沉積成為主要的內(nèi)源性鉛來(lái)源，當(dāng)血液鉛含量減少時(shí)，骨骼鉛含量隨之降低，導(dǎo)致血樣的鉛含量再次升高[12-13]。實(shí)驗(yàn)組血鉛濃度回升較弱說(shuō)明其能有效地降低機(jī)體內(nèi)的鉛總量和骨骼中的鉛含量。

2014年，SUNG通過(guò)病理觀察和生化指標(biāo)檢測(cè)證明大鼠連續(xù)90 d每天口服攝入1 000 mg/kg納米碳酸鈣（劑量/大鼠體重），無(wú)毒副作用[14]。本實(shí)驗(yàn)所用碳酸鈣劑量和給藥周期均小于該實(shí)驗(yàn)，且已具有良好的驅(qū)鉛效果，另外碳酸鈣與Pb2+反應(yīng)產(chǎn)生的Ca2+還可以作為鉛中毒患者的補(bǔ)鈣劑，補(bǔ)充其因鉛中毒造成的血鈣濃度下降[15]。雖然臨床證明絡(luò)合劑藥物有穩(wěn)定的驅(qū)鉛效果，但是長(zhǎng)期服用會(huì)伴隨不同程度的副作用，例如：①惡心、嘔吐及肌肉痛等癥狀；②特異性差，導(dǎo)致體內(nèi)的其他微量元素流失[16]；③長(zhǎng)期服用增加腎臟負(fù)擔(dān)，引發(fā)腎臟疾病[17-18]。

綜上所述，納米碳酸鈣（40～80 nm）具有高效的驅(qū)鉛能力，靶向明確，可以作為新型驅(qū)鉛藥物的模型。

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Therapeutic effect of calcium carbonate nanoparticle on lead poisoning*

Xuan-yi Zhu1,Yan-ning Huang2,Fang-ming Mo1,Yi-feng Pan1,Jian-tai He3,Ping Xiao2
(1.Key Laboratory of Nanobiotechnology of Ministry of Health,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;2.Department of Nephrology,3.Department of General Surgery,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

R135.11

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.003

1005-8982（2017）15-0011-04

2017-05-08

衛(wèi)生部國(guó)際科技合作項(xiàng)目（No：2013DFA31440）

肖平，E-mail：xiaoping@163.com；Tel：13786121955