白細(xì)胞介素17及23在慢性放射性腸炎中的表達(dá)及臨床意義*

吳長亮，姚莉，蔡福慶，彭鵬，黃杰安

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

臨床研究·論著

白細(xì)胞介素17及23在慢性放射性腸炎中的表達(dá)及臨床意義*

吳長亮，姚莉，蔡福慶，彭鵬，黃杰安

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

目的檢測(cè)白細(xì)胞介素17（IL-17）和白細(xì)胞介素23（IL-23）在慢性放射性腸炎患者腸黏膜組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與疾病的關(guān)系。方法納入31例慢性放射性腸炎為研究對(duì)象，選取健康對(duì)照30例。對(duì)病情的評(píng)估采取臨床癥狀和內(nèi)鏡下表現(xiàn)結(jié)合的形式。用免疫組織化學(xué)法測(cè)定IL-17及IL-23的蛋白表達(dá)，并分析其與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果慢性放射性腸炎中IL-17及IL-23的陽性表達(dá)高于正常腸黏膜組織（均P=0.000）。IL-17及IL-23在慢性放射性腸炎患者腸黏膜中的表達(dá)與癥狀積分及內(nèi)鏡評(píng)分呈正相關(guān)（均P=0.000）。慢性放射性腸炎患者腸黏膜中IL-17與IL-23的表達(dá)相關(guān)（r=0.731，P=0.000）。結(jié)論IL-17及IL-23在慢性放射性腸炎組織中高表達(dá)，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示IL-17/IL-23免疫軸可能參與慢性放射性腸炎的發(fā)生、發(fā)展。

慢性放射性腸炎；白細(xì)胞介素17；白細(xì)胞介素23

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of the IL-17 and IL-23 in chronic radiation proctitis(CRP).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of IL-17 and IL-23 in 31 CRP patients and 30 normal colonic mucosal tissues.ResultsThe positive expression of IL-17 and IL-23 in CRP was higher than that in normal colonic mucosal tissues (P=0.000).The expression of IL-17 and IL-23 in CRP significantly correlated with the parameters of symptoms and endoscopic scores (P=0.000).There was a significant correlation between the expression of IL-17 and IL-23 in the intestinal mucosa of patients with CRP (rs=0.731,P=0.000).ConclusionsIL-17/IL-23 axis may play an important role in the development and progression of CRP.

Keywords:chronic radiation proctitis;interleukin 17;interleukin 23

放射性腸炎是腹盆腔惡性腫瘤放射治療引起的常見并發(fā)癥，根據(jù)起病的緩急和病程的長短，一般分為急性和慢性。急性放射性腸炎多出現(xiàn)在放療期間，病情較輕，多數(shù)可自愈。但仍有部分可進(jìn)一步發(fā)展，持續(xù)≥3個(gè)月的稱為慢性放射性腸炎。慢性放射性腸炎臨床上以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、便血及里急后重等為特點(diǎn)，內(nèi)鏡主要表現(xiàn)為慢性潰瘍、出血、穿孔、腸梗阻及瘺管形成，病情常遷延不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前，慢性放射性腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與放射劑量大小、腸道屏障破壞、腸壁血管損傷及菌群失調(diào)等因素相關(guān)[2]。近年來，隨著對(duì)放射性損傷的深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到其發(fā)病機(jī)制與免疫細(xì)胞因子存在密切關(guān)系[3]。白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）及白細(xì)胞介素23（interleukin-23，IL-23）免疫軸是近年來研究的熱點(diǎn)，其在多種自身免疫性疾病包括炎癥性腸病及腸道慢性炎癥中有重要作用[4]。本課題旨在通過測(cè)定IL-17/IL-23免疫軸中的重要生物分子IL-17及IL-23在慢性放射性腸炎組織中的表達(dá)，初步探討IL-17/IL-23免疫軸對(duì)慢性放射性腸炎發(fā)生、發(fā)展的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月-2015年1月本院診斷為慢性放射性腸炎的患者31例納入研究。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)《放射性直腸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》GBZ111-2002。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的腹盆腔惡性腫瘤放射治療病史；②于放射治療結(jié)束3個(gè)月以后出現(xiàn)以結(jié)腸受累為主的放射性腸炎的相關(guān)癥狀，或癥狀持續(xù)≥3個(gè)月；③經(jīng)病理檢查排除腫瘤局部轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)；④既往無結(jié)直腸炎病史。31例慢性放射性結(jié)腸炎均為女性宮頸癌患者，年齡 38～72歲，平均（48.8±8.41）歲，未行手術(shù)治療，所有患者接受放射治療（外照射+后裝），同步予順鉑[cis-Dichlorodiammineplatinum（Ⅱ），DDP]及5-氟尿嘧啶化療，均為放療結(jié)束后3～10個(gè)月發(fā)病的患者。以正常腸黏膜組織30例作為對(duì)照組。本研究通過廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 慢性放射性腸炎病情評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)病情的評(píng)估采取臨床癥狀和內(nèi)鏡下表現(xiàn)相結(jié)合的形式。臨床癥狀參照SOMA（subjective objective management analysis）進(jìn)行評(píng)定（見表1）；目前對(duì)放射性腸炎的內(nèi)鏡下病變?cè)u(píng)估尚無標(biāo)準(zhǔn)的方法，本實(shí)驗(yàn)采用5個(gè)常見的內(nèi)鏡下病變：毛細(xì)血管擴(kuò)張、黏膜潮紅水腫、潰瘍、狹窄及壞死相結(jié)合的評(píng)分系統(tǒng)來評(píng)估內(nèi)鏡下病變。見表2。

表1 慢性放射性腸炎癥狀的SOMA評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 慢性放射性腸炎內(nèi)鏡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 IL-17及IL-23抗體（購自英國Abcam公司），即用型免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB酶底物顯色劑（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），常規(guī)脫蠟、水化，以0.01 mol/L檸檬酸高壓修復(fù)5 min，3%過氧化氫H2O2室溫孵育5～10 min，正常山羊血清封閉10 min后，滴加一抗（IL-17和IL-23 P19濃度均為1∶400），孵育過夜，余步驟嚴(yán)格遵照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陽性對(duì)照由試劑公司提供，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的黃色或黃褐色顆粒視為免疫組織化學(xué)染色陽性，綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。根據(jù)免疫陽性細(xì)胞染色程度（A）：①無染色為0分；②細(xì)胞膜或質(zhì)內(nèi)見淡黃色顆粒，高于背景為1分；③較多棕黃色顆粒為2分；④大量棕黃色顆粒為3分。每片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500數(shù)（B）：①陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；②5%～25%為1分；③25%～50%為2分；④>50%為3分。A與B相加為其最后得分：①0分判為“-”；②1～2分判為“+”；③3～4 分判為“++”；④5～6 分判為“+++”。以“++”和“+++”定義為陽性表達(dá)，“-”和“+”定義為陰性表達(dá)[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用個(gè)數(shù)（%）表示。率的比較用χ2檢驗(yàn)。IL-17及IL-23 P19表達(dá)程度與臨床癥狀和內(nèi)鏡評(píng)分的比較做秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），相關(guān)分析用Pearson法或Spearman法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17及IL-23在腸黏膜中的表達(dá)

IL-17及IL-23主要表達(dá)于胞質(zhì)（見附圖）。IL-17及IL-23在在慢性放射性腸炎中的陽性率均高于正常腸黏膜（均P=0.000）。見表3。

2.2 IL-17及IL-23的表達(dá)與慢性放射性腸炎患者臨床特征的關(guān)系

附圖 IL-17和IL-23在正常腸黏膜、慢性放射性腸炎結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá) （SP×200）

表3 慢性放射性腸炎組織與正常腸黏膜組織IL-17及IL-23陽性表達(dá)率的比較 例（%）

對(duì)不同疾病嚴(yán)重程度和IL-17及IL-23不同表達(dá)等級(jí)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IL-17及IL-23在不同的疾病嚴(yán)重程度分級(jí)中的表達(dá)水平有差異（見表4）。進(jìn)一步進(jìn)行Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IL-17及IL-23在慢性放射性腸炎中的表達(dá)水平與臨床癥狀積分、內(nèi)鏡表現(xiàn)呈正相關(guān)。隨著臨床癥狀的加重，IL-17及IL-23的表達(dá)強(qiáng)度等級(jí)越高。見表5。

2.3 慢性放射性腸炎中IL-17與IL-23表達(dá)的相關(guān)性

通過相關(guān)分析，慢性放射性腸炎中IL-17與IL-23表達(dá)呈正相關(guān)。見表6。

表4 不同臨床特征IL-17及IL-23P19表達(dá)等級(jí)的比較

表5 IL-17及IL-23 P19的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性

表6 慢性放射結(jié)腸炎中IL-17與IL-23表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

目前，尚未有明確的治療放射性腸炎的指南，臨床上多采用內(nèi)科解痙、止痛、止血、抗感染及對(duì)癥支持治療，但效果不盡理想[6-7]。雖然大部分的急性放射性腸炎有自愈性，但仍然有部分患者持續(xù)發(fā)展成為癥狀復(fù)雜而頑固的慢性放射性腸炎，給患者帶來巨大的痛苦。研究慢性放射性腸炎的發(fā)病機(jī)制及防治對(duì)策，是臨床亟需解決的重要問題。隨著對(duì)放射性損傷的深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到其發(fā)病機(jī)制與免疫細(xì)胞因子存在密切關(guān)系[8-10]。IL-17/IL-23免疫軸在多種自身免疫性疾病、腸道慢性炎癥、腫瘤及移植排斥中發(fā)揮重要作用[11-12]，近年來，IL-17/IL-23免疫軸已成為放射損傷免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。王潔等以放射性肺炎大鼠為研究對(duì)象，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血輔助性 T 細(xì)胞 17（helper T cell 17，Th17）細(xì)胞數(shù)的變化以及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Th17在肺組織的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)放射性肺炎大鼠全血中Th17細(xì)胞逐漸上升，在放射性肺炎組織中，Th17細(xì)胞數(shù)量增多，提示Th17細(xì)胞可能參與大鼠放射性肺炎形成過程。有課題組進(jìn)一步以148例實(shí)施放療的胸部腫瘤患者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)放療前、放療期間及放療后第4周研究對(duì)象外周血中Th17細(xì)胞水平并分析其與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生放射性肺炎患者的Th17細(xì)胞水平高于未發(fā)生放射性肺炎的患者[13-14]。目前，針對(duì)IL-17/IL-23免疫軸與放射性腸炎關(guān)系的相關(guān)研究較少。

本實(shí)驗(yàn)探討IL-17/IL-23免疫軸是否在放射性腸黏膜損傷過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-17及IL-23在慢性放射性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織中高表達(dá)，而在正常腸黏膜組織中低表達(dá)，提示慢性放射性腸炎腸黏膜組織中可能有IL-17及IL-23細(xì)胞的浸潤。進(jìn)一步分析IL-17和IL-23的表達(dá)與疾病炎癥程度的關(guān)系，結(jié)果顯示臨床癥狀越嚴(yán)重、腸黏膜受損越大的患者，IL-17及IL-23蛋白表達(dá)的強(qiáng)度越高。說明腸黏膜IL-17及IL-23的表達(dá)水平與慢性放射性腸炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，兩者可能促進(jìn)放射性腸炎的慢性化及病情進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中，IL-17與IL-23的表達(dá)呈正相關(guān)，其可能的機(jī)制是IL-23通過刺激促使Th17釋放大量IL-17，兩者在慢性放射性腸炎的發(fā)病機(jī)制中起積極作用。

本課題著眼于慢性放射性腸炎的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)IL-17及IL-23在慢性放射性腸炎患者中高表達(dá)，提示慢性放射性腸炎患者的促炎因子和抗炎因子的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，促炎因子的上調(diào)可能是放射性腸炎發(fā)生、發(fā)展和慢性化的重要因素。對(duì)于IL-17及IL-23表達(dá)增加的慢性放射性腸炎，調(diào)控IL-17/IL-23免疫軸的應(yīng)答，阻斷其致炎過程，是否也有希望成為未來研發(fā)新藥物的炎癥靶標(biāo)？這需要更深入的研究。

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Expression of IL-17 and IL-23 in chronic radiation colitis*

Chang-liang Wu,Li Yao,Fu-qing Cai,Peng Peng,Jie-an Huang
(Department of Gastroenterology,yhe Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021,China)

R516.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.007

1005-8982（2017）15-0034-04

2017-02-28

廣西衛(wèi)生廳自籌課題（No：Z2013100）

黃杰安，E-mail：jieanh@163.com