肖佳靈　高金星　程剛

[摘要] 目的 本研究旨在評價RUNX2基因rs1406846位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族女性顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性。方法 依據(jù)顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病研究診斷標(biāo)準(zhǔn)（RDC/TMD），共納入240例受試者，包括114例TMJOA患者和126例健康的女性對照。運(yùn)用測序的方法檢測RUNX2基因上rs1406846位點(diǎn)的多態(tài)性，并采用Logistic回歸模型對基因型、等位基因、攜帶頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（SPSS 20.0）。結(jié)果 中國漢族女性TMJOA組中攜帶RUNX2-rs1406846上TT基因型和對照組的AA基因型相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.032），T等位基因頻率在TMJOA組中明顯高于健康對照組（64.0% vs 54.4%， P=0.032）。結(jié)論 單核苷酸多態(tài)性研究顯示，在中國漢族女性的TMJOA人群中RUNX2基因和TMJOA具有相關(guān)性，其中T等位基因可能是該疾病的危險因素。

[關(guān)鍵詞] 顳下頜關(guān)節(jié)；骨關(guān)節(jié)炎；單核苷酸多態(tài)性；RUNX2

[中圖分類號] R782.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）19-0001-04

[Abstract] Objective To evaluate the association between rs1406846 polymorphism of RUNX2 gene and temporomandibular joint osteoarthritis in Chinese Han females. Methods A total of 240 subjects， including 114 TMJOA patients and 126 healthy female controls were enrolled， according to the diagnostic criteria for temporomandibular disorders（RDC/TMD）. The polymorphism of rs1406846 locus of RUNX2 gene was detected by sequencing. And the genotype， allele and frequency distribution were analyzed by Logistic regression model（SPSS 20.0）. Results There was statistically significant difference between TT genotype of RUNX2-rs1406846 gene in the Chinese Han female TMJOA group and AA genotype in the control group（P=0.032）. T allele frequency was significantly higher in the TMJOA group than that in the healthy control group（64.0% vs 54.4%， P=0.032）. Conclusion The single nucleotide polymorphism study shows that there is correlation of RUNX2 gene and TMJOA in the TMJOA population of Han Chinese women， and the T allele might be the risk factor of the disease.

[Key words] Temporomandibular joint； Osteoarthritis； Single nucleotide polymorphism； RUNX2

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞和損耗為主要病理學(xué)特征，伴有軟骨下骨組織改建和滑膜相應(yīng)病變的一種退行性疾病。該病發(fā)病隱匿，病程遷延，可導(dǎo)致功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，臨床上尚缺乏有效的治療手段。目前認(rèn)為OA是一種多基因參與的復(fù)雜性疾病，是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致，遺傳因素賦予患者疾病的易感性[1-3]。顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）在頜面部的生長發(fā)育中起著重要作用，其結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，較易罹患骨關(guān)節(jié)炎。近年來，基因多態(tài)性與疾病易感性的分子流行病學(xué)研究迅速發(fā)展，作為第三代遺傳標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在基因組中具有密度高、保守、穩(wěn)定和易于分型的優(yōu)點(diǎn)，在疾病特別是多基因疾病發(fā)病中具有重要作用。RUNX2是骨和軟骨發(fā)育和分化重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并且在歐洲人群的全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)RUNX2和大關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎存在潛在的相關(guān)性[4]。RUNX2上多態(tài)性位點(diǎn)rs1406846和股骨與脛骨的發(fā)育長度存在明顯的相關(guān)性，并且女性個體顯示出更強(qiáng)的遺傳相關(guān)性[5]。本研究通過DNA測序法對114例女性TMJOA患者和126例健康人進(jìn)行檢測，通過對兩組人群進(jìn)行比較，探討RUNX2-rs1406846多態(tài)性位點(diǎn)與中國漢族女性TMJOA之間的相關(guān)性，為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中遺傳多態(tài)性的進(jìn)一步研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年8月～2016年12月在本院口腔科就診的漢族女性患者。TMJOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)RDC/TMD（Research Diagnostic Criteria for Temporomandibular Disorders）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[6]。臨床診斷為顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病，并行曲面體層、CBCT檢查，影像學(xué)上至少一側(cè)存在髁突磨平、硬化、骨質(zhì)增生、破壞、囊樣變等表現(xiàn)而確診為OA的患者[7]（封三圖 1 A、B和C）。所有病例均為散發(fā)病例，無家族史，病例組（TMJOA組）年齡12～60歲，平均（33.59±14.31）歲。健康對照：選取同時段內(nèi)在本院口腔頜面外科就診因正畸需要、阻生智齒需拔牙、修復(fù)需要行牙槽外科手術(shù)的患者以及部分院內(nèi)職工和志愿者學(xué)生，全身情況良好，既往無顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病及其他關(guān)節(jié)炎的病史，家族中亦無風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他結(jié)締組織疾病史，曲面體層或CBCT檢查無明確OA者。對照組平均年齡（31.37±9.96）歲。病例組和對照組在年齡、性別等一般資料上具有可比性，所有患者均自愿參加本研究，入組前簽署知情同意書。

1.2 樣本收集

病例組與對照組均于空腹時一次性抽取外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，-80℃保存。血樣在24 h內(nèi)進(jìn)行處理、標(biāo)記、登記、凍存。由專人負(fù)責(zé)將臨床資料、一般情況等數(shù)據(jù)錄入。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取采用常規(guī)的酚/氯仿提取法提取基因組DNA，并溶于TE緩沖液中，獲得的基因組DNA用NanoDrop測OD值和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物 參照Gene Bank中RUNX2基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計合成引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物：5′-AGCATGGCACCCAATCCTTTA-3′，下游引物：5′-GCAAGGCTGTTTCCGATGAG-3′。

1.3.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板（40 ng/μL）1 μL，引物P1、P2各0.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（1U/μL）0.5 μL，滅菌三蒸水19.5 μL。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性2 min后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)為98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min。最后4℃保存。取PCR產(chǎn)物3 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.3.4 DNA測序 樣品采用DNA測序方法對單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測分型，通過測序峰圖對SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對分型，所有測序工作均由華大基因公司完成（中國）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用軟件SPSS 20.0對多態(tài)性位點(diǎn)等位型、基因型和等位基因頻率、所有樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以百分比表示，組間兩兩比較用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，多組間比較用Logistic回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

擴(kuò)增出的目的片段大小為475 bp，基因組DNA和PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見封三圖 2。

2.2 測序峰圖

根據(jù)測序后單核苷酸多態(tài)性分型結(jié)果，RUNX2基因rs1406846多態(tài)性位點(diǎn)基因型為TT型、TA型以及AA型。RUNX2-rs1406846位點(diǎn)的測序分型如封三圖 3。

2.3 基因型和等位基因頻率

入組的樣本共240例，包括TMJOA組114例，健康對照組126例，均為中國漢族女性（具體入組樣本信息見表 1）。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)-rs1406846的基因型和等位基因頻率滿足哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium），TMJOA組和健康對照組在年齡上沒有統(tǒng)計學(xué)差異[（33.59±14.31）歲 vs（31.37±9.96）歲，P=0.16]，排除年齡因素對分析結(jié)果的影響。

相關(guān)性檢測分析發(fā)現(xiàn)RUNX2基因的SNP位點(diǎn)-rs1406846和中國漢族女性TMJOA易感性具有相關(guān)性。RUNX2-rs1406846上的T等位基因頻率在TMJOA組明顯高于健康對照組（64.0% vs 54.4%，P=0.032），且其在TMJOA中TT基因型和對照組的AA基因型比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.032），而攜帶雜合子TA基因型的相比于AA基因型攜帶者未顯著增加患TMJOA的風(fēng)險（OR=1.71，95% CI：0.81～3.59，P=0.158）。見表 2。

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（temporomandibular joint osteoarthritis， TMJOA）是口腔頜面部的一種常見病，與大關(guān)節(jié)OA有許多類似的表現(xiàn)，但又有其自身特點(diǎn)。由于下頜髁突是頜面部的生長發(fā)育中心，TMJOA不僅影響顳下頜關(guān)節(jié)的功能運(yùn)動，而且會影響頜面部的正常發(fā)育，造成下頜骨發(fā)育不良、錯頜畸形等。因此，TMJOA不僅影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能造成患者的心理障礙。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展隨著時間的推移逐漸加重并且早期癥狀往往不明顯，因此開發(fā)與疾病進(jìn)程相適應(yīng)的治療藥物十分困難。另一方面，對OA早期患者缺乏有效的可供篩查的生物標(biāo)記和敏感的檢測技術(shù)，臨床上也難以及時采取有效的治療或干預(yù)措施。單核苷酸多態(tài)性具有分布廣泛、高度穩(wěn)定、易于自動化分析等優(yōu)點(diǎn)，其反映了人群的遺傳背景對疾病的易感性，是一種理想的生物學(xué)標(biāo)志物。遺傳修飾改變的檢測對于疾病診斷、治療以及藥物研發(fā)具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景[3]。目前研究較多的OA易感基因有生長分化因子5、雌激素受體基因、鈣調(diào)蛋白基因-1、無孢蛋白基因、分泌型卷曲相關(guān)蛋白基因、白介素-1相關(guān)基因等[8，9]，但OA易感基因在不同性別、不同人種以及不同關(guān)節(jié)中有所差別，且其作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

RUNX2是轉(zhuǎn)錄因子RUNXX家族成員之一，作為一個具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)肥大軟骨細(xì)胞中X型膠原、磷蛋白、涎蛋白和MMP13表達(dá)的能力，被認(rèn)為是晚期軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[10-13]。為了維持軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)，在小鼠TMJ和膝關(guān)節(jié)的軟骨表層細(xì)胞中，RUNX2的表達(dá)常常受到抑制[14]，而SMAD3本身可以通過促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)以及抑制RUNX2誘導(dǎo)的MMP13的表達(dá)，使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解保持平衡[15]。RUNX2基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的軟骨細(xì)胞分化延遲和軟骨內(nèi)成骨缺陷，并且具有顯性抑制效應(yīng)的RUNX2通過調(diào)控Ⅱ型膠原啟動子區(qū)使小鼠表現(xiàn)出類似的軟骨發(fā)育缺陷[16-18]。另一方面，RUNX2作為骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，對骨組織的形成和重建也起著重要作用。RUNX2上多態(tài)性位點(diǎn)和骨骼的發(fā)育亦存在相關(guān)性，其上的SNP位點(diǎn)rs2819858、rs1406846、rs2819854和股骨和脛骨的長度存在明顯的相關(guān)性[5]。Grcevic D等[19]學(xué)者通過外周血表達(dá)譜檢測發(fā)現(xiàn)，RUNX2表達(dá)水平的改變可以作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、OA等多種骨關(guān)節(jié)病中骨代謝水平的潛在標(biāo)志物。Gelse K等[20]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在人膝關(guān)節(jié)OA骨刺中對比正常關(guān)節(jié)軟骨，RUNX2 mRNA表達(dá)水平升高12.7倍。本研究發(fā)現(xiàn)RUNX2-rs1406846和中國漢族女性TMJOA具有相關(guān)性，該SNP位點(diǎn)位于RUNX2的內(nèi)含子區(qū)域，其遺傳相關(guān)性可能通過和其他SNP位點(diǎn)連鎖不平衡或影響RUNX2的表達(dá)或下游蛋白的功能，具體功能有待于進(jìn)一步研究。

隨著遺傳學(xué)與分子流行病學(xué)研究的迅速發(fā)展，SNPs與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)性的研究日漸深入，易感基因多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)將有助于提高人們對OA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識以及指導(dǎo)疾病的早期預(yù)防和治療。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少OA易感基因，并對其SNPs位點(diǎn)進(jìn)行了較多研究，但是對于同一基因同一SNP在不同關(guān)節(jié)、不同種族、不同性別以及不同年齡的研究結(jié)果并不完全一致[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族女性人群中，RUNX2基因上rs1406846多態(tài)性位點(diǎn)和顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎易感性具有相關(guān)性，其中T等位基因可能是該疾病的危險因素。該研究結(jié)果僅代表該多態(tài)性位點(diǎn)在中國漢族女性TMJOA中的分布情況，樣本量較小，且未對其他種族和男性TMJOA人群進(jìn)行相關(guān)性分析，以上結(jié)果為今后大樣本、多中心的TMJOA遺傳學(xué)研究提供初步的研究思路和實驗依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Felson DT，Naimark A，Anderson J，et al. The prevalence of knee osteoarthritis in the elderly. The framingham osteoarthritis study[J]. Arthritis Rheum，1987，30（8）：914-918.

[2] Valdes AM，Spector TD. The clinical relevance of genetic susceptibility to osteoarthritis[J].Best Pract Res Clin Rheumatol， 2010，24（1）：3-14.

[3] MacGregor AJ，Antoniades L，Matson M，et al. The genetic contribution to radiographic hip osteoarthritis in women：Results of a classic twin study[J].Arthritis Rheum， 2000，43（11）：2410-2416.

[4] Arc OC，Zeggini E. Identification of new susceptibility loci for osteoarthritis（arcogen）：A genome-wide association study[J].Lancet 2012，380（9844）：815-823.

[5] Ermakov S，Malkin I，Kobyliansky E，et al. Variation in femoral length is associated with polymorphisms in runx2 gene[J].Bone 2006，38（2）：199-205.

[6] Schiffman E，Ohrbach R，Truelove E，et al. Diagnostic criteria for temporomandibular disorders（dc/tmd）for clinical and research applications：Recommendations of the international rdc/tmd consortium network and orofacial pain special interest groupdagger[J].J Oral Facial Pain Headache，2014， 28（1）：6-27.

[7] Dworkin SF，LeResche L. Research diagnostic criteria for temporomandibular disorders：Review，criteria，examin-ations and specifications，critique[J].J Craniomandib Disord， 1992，6（4）：301-355.

[8] Miyamoto Y，Mabuchi A，Shi D，et al. A functional polymorphism in the 5'UTR of GDF5 is associated with susceptibility to osteoarthritis[J].Nat Genet 2007，39（4）：529-533.

[9] Ushiyama T，Ueyama H，Inoue K，et al. Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis[J].J Rheumatol，1998，25（1）：134-137.

[10] Komori T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by runx2[J].Cell Tissue Res，2010，339（1）： 189-195.

[11] Tetsunaga T，Nishida K，F(xiàn)urumatsu T，et al. Regulation of mechanical stress-induced mmp-13 and adamts-5 expression by runx-2 transcriptional factor in sw1353 chondrocyte-like cells[J].Osteoarthritis Cartilage，2011， 19（2）：222-232.

[12] Inada M，Wang Y，Byrne MH，et al. Critical roles for collagenase-3（mmp13）in development of growth plate cartilage and in endochondral ossification[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（49）：17192-17197.

[13] Fosang AJ，Last K，Knauper V，et al. Degradation of cartilage aggrecan by collagenase-3（mmp-13）[J].FEBS Lett，1996，380（1-2）：17-20.

[14] Kuboki T，Kanyama M，Nakanishi T，et al. Cbfa1/runx2 gene expression in articular chondrocytes of the mice temporomandibular and knee joints in vivo[J].Arch Oral Biol，2003，48（7）：519-525.

[15] Chen CG，Thuillier D，Chin EN，et al. Chondrocyte-intrinsic smad3 represses runx2-inducible matrix metalloproteinase 13 expression to maintain articular cartilage and prevent osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2012，64（10）：3278-3289.

[16] Ueta C，Iwamoto M，Kanatani N，et al. Skeletal malformations caused by overexpression of cbfa1 or its dominant negative form in chondrocytes[J].J Cell Biol，2001， 153（1）：87-100.

[17] Fujita T，Azuma Y，F(xiàn)ukuyama R，et al. Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with pi3k-akt signaling[J].J Cell Biol，2004，166（1）： 85-95.

[18] Inada M，Yasui T，Nomura S，et al.Maturational distur-bance of chondrocytes in cbfa1-deficient mice[J].Dev Dyn，1999，214（4）： 279-290.

[19] Grcevic D，Jajic Z，Kovacic N，et al. Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins tumor necrosis factor-superfamily molecules，and transcription factor runx2 could be used as markers of the form of arthritis，disease activity，and therapeutic responsiveness[J].J Rheumatol，2010，37（2）： 246-256.

[20] Gelse K，Ekici AB，Cipa F，et al. Molecular differentiation between osteophytic and articular cartilageclues for a transient and permanent chondrocyte phenotype[J].Osteoarthritis Cartilage，2012，20（2）：162-171.

[21] Reynard LN，Loughlin J. Insights from human genetic studies into the pathways involved in osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2013，9（10）：573-583.

（收稿日期：2017-05-08）