張雪 戴媛媛 韓現(xiàn)芹 高燕

摘要 [目的]明確固定化藻類技術(shù)應(yīng)用于凈化海水養(yǎng)殖廢水的可行性。[方法]采用海藻酸鈣凝膠包埋固定的方法，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期的普通小球藻進(jìn)行固定，制備3、4、5 mm不同粒徑的固定化藻球，比較懸浮藻與不同粒徑固定化藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮和無(wú)機(jī)磷的去除率及微藻的生長(zhǎng)特性。并選擇直徑為4 mm的藻球、空白膠球、懸浮藻液分別按10%和15%的填充率投放入海水養(yǎng)殖廢水中，研究不同填充率條件下藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮和無(wú)機(jī)磷的凈化效果。[結(jié)果]4 mm固定化藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除率較高，填充率為15%條件下去除效果更佳，但藻細(xì)胞生長(zhǎng)被延緩。[結(jié)論]該研究可為固定化小球藻處理海水養(yǎng)殖廢水的工廠化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 固定化藻；海水養(yǎng)殖廢水；NH+4-N；PO3-4-P；去除率

中圖分類號(hào) S949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0047-03

Research on Purification Effect for Nitrogen and Phosphorus in Mariculture Wastewater by Immobilized Algae

ZHANG Xue， DAI Yuan-yuan， HAN Xian-qin et al

（Tianjin Bohai Sea Fisheries Research Institute， Tianjin 300457）

Abstract [Objective] The feasibility of the application of immobilized algae technology in the purification of mariculture wastewater was explored. [Method] Different diameter size of algae ball as 3， 4， 5 mm was made from the immobilized Chlorella vugaris training to the end of logarithm with the method of embedding fixed calcium alginate gel，different diameter size algae ball with suspended algae on removal rate of ammonia nitrogen and inorganic phosphorus and the growth characteristic of the algae cell in mariculture wastewater were compared. And choosing the 4 mm diameter algae ball， putting them into the mariculture wastewater with blank plastic ball and suspended algae respectively according to the filling rate of 10% and 15%， the purification efficiency of ammonia nitrogen and inorganic phosphorus in aquaculture wastewater was studied. [Result] The results showed that the removal rate of nitrogen and phosphorus was higher under the condition of the immobilized algae ball in 4 mm diameter size and 15% filling rate in mariculture wastewater， but the growth of algae cells in fixed algal ball was delayed. [Conclusion] The study can provide scientific basis for factory application of the treatment of mariculture wastewater by immobilized algae technology.

Key words Immobilized algae；Mariculture wastewater；NH+4-N；PO3-4-P；Removal rate

微藻固定化技術(shù)是利用載體將藻類細(xì)胞固定，形成固定化藻類系統(tǒng)，該系統(tǒng)不僅不溶解于水，并且細(xì)胞具有良好的生物活性，該技術(shù)起始于1969年日本生物學(xué)家千畑一郎創(chuàng)建的固定化技術(shù)。固定化技術(shù)早期用于固定化酶，隨后用于細(xì)菌、酵母等微生物活細(xì)胞的固定化培養(yǎng)。1979年被Brodelius用于植物細(xì)胞的固定化培養(yǎng)[1]，到20世紀(jì)90年代才對(duì)固定化微藻培養(yǎng)展開一些探索性的研究[1-2]。

早期研究表明，微藻固定化培養(yǎng)具有廣闊的應(yīng)用前景，如次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)[3]、種質(zhì)保存[4]、污水處理[5-14]等。其中，固定化藻類處理污水是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)污水處理新技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用于污水處理，具有藻細(xì)胞濃度高、反應(yīng)速度快、藻細(xì)胞易于收獲等優(yōu)勢(shì)[5-6]。藻類固定化以后，提高了對(duì)廢水中氮、磷和重金屬等廢物的吸收和富集[7-8]，隨著固定化微藻處理污水技術(shù)的成熟，學(xué)者開始進(jìn)行一些深入性的研究，如固定劑的選擇、藻類的篩選、影響固定化藻類對(duì)廢水中氮、磷去除的理化因素等[7]。國(guó)內(nèi)在這方面的研究多集中于對(duì)淡水微藻的固定化培養(yǎng)及其處理市政污水、印染廢液等[10-13]，而對(duì)海洋微藻固定化方面的研究不多，只有Hertzberg等[2]和馬志珍等[4，15]曾開展過(guò)一些重要的基礎(chǔ)研究。

近年來(lái)，隨著工廠化海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展壯大，養(yǎng)殖企業(yè)為降低成本將未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水任意排放，廢水中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流入河流、湖泊和大海，加劇了水體富營(yíng)養(yǎng)化，給水資源造成了嚴(yán)重威脅。因此，尋找一種廉價(jià)、快捷治理海水養(yǎng)殖廢水的方法刻不容緩。

筆者利用固定化藻類技術(shù)，研究去除海水養(yǎng)殖廢水中氮、磷的方法，旨在為固定化小球藻處理海水養(yǎng)殖廢水中氮、磷的工廠化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通小球藻（Chlorella vugaris）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所。試驗(yàn)用水采自天津漢沽興盛養(yǎng)殖場(chǎng)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖廢水池，經(jīng)過(guò)濾、加熱滅菌處理以排除試驗(yàn)中其他干擾因素。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

微藻培養(yǎng)。

在無(wú)菌條件下，用移液槍接種一定量的藻種于含300 mL f/2培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，使培養(yǎng)基的接種密度為1×106個(gè)/mL，混勻，在溫度（25±1）℃、t（光）∶t（暗）=1∶1、光強(qiáng)2 000 lx的條件下培養(yǎng)，定時(shí)搖動(dòng)2次/d。

1.2.2 藻類固定化方法。

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末的微藻在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心濃縮10 min，棄上清液，用滅菌蒸餾水沖洗并離心2～3次以去除附著在微藻表面的氮和磷，然后將離心后的濃縮液懸浮于滅菌蒸餾水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后取一定體積濃縮液，與預(yù)先高壓滅菌冷卻的5%海藻酸鈉等體積混勻，用無(wú)菌注射器吸取，滴入3%預(yù)冷的CaCl2液面，制成固定化藻球，放置12 h使海藻酸鈉與CaCl2充分反應(yīng)，無(wú)菌水或養(yǎng)殖廢水洗滌2～3次。

1.2.3 固定化藻球脫固定化方法。

固定化微藻中藻細(xì)胞的測(cè)定，是將固定化小球藻放入盛有3%檸檬酸鈉溶液的小燒杯中，置于振蕩器上振蕩至膠球全部溶解，取一定量藻液至于血球計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，每組3次重復(fù)。

1.2.4 營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定方法。

參照國(guó)家《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB 17378.4—2007），采用次溴酸鹽氧化法測(cè)定氨態(tài)氮含量；采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同粒徑的固定化藻球制備方法。

利用藻類固定化方法，采用不同型號(hào)（0.8#、1.2#、1.6#）的注射器制備粒徑分別為3、4、5 mm的固定化藻類。

1.3.2 投放率影響試驗(yàn)。

選取直徑為4 mm的固定化藻球、空白膠球（CK）與懸浮態(tài)小球藻，分別按固定化藻球、空白膠球及懸浮藻液體積占總體積的10%和15%的投放率放入盛有500 mL處理過(guò)的海水養(yǎng)殖廢水的錐形瓶中，并且試驗(yàn)組和對(duì)照組（CK）都設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)溫度（25±1） ℃，t（光）∶t（暗）=1∶1，光強(qiáng)2 000 lx，定時(shí)搖動(dòng)2次/d，每天定時(shí)測(cè)定海水養(yǎng)殖廢水中氨氮和無(wú)機(jī)磷的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以 P<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸浮藻與不同粒徑固定化藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除效果

從圖1、2可以看出，固定化藻球?qū)Π钡?、無(wú)機(jī)磷的去除率顯著高于懸浮藻。不同粒徑固定化藻類對(duì)氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除效果也不同，4 mm固定化藻球的去除效果較顯著，3 mm固定化藻球次之，5 mm固定化藻球稍差。

圖1顯示，試驗(yàn)第1天，固定化藻球的去除效果優(yōu)于懸浮藻，4 mm固定化藻球的去除效果最好，在40%以上。隨后2 d懸浮藻與固定化藻球的去除效果逐漸拉開差距，且4 mm固定化藻球的去除率顯著高于其他直徑藻球。第4天，4 mm固定化藻球的去除率達(dá)到90%以上并趨于平穩(wěn)，3、5 mm固定化藻球的去除率達(dá)到80%以上，懸浮藻的去除率逐漸增大，達(dá)80%左右。

圖2顯示，試驗(yàn)第1天，固定化藻球的去除率稍優(yōu)于懸浮藻，不同粒徑固定化藻球的去除率無(wú)明顯差異；第2天懸浮藻與固定化藻球的去除率開始有明顯差距，固定化藻球的去除率顯著高于懸浮藻，且4 mm固定化藻球的去除率顯著高于其他組，隨后固定化藻球的去除率變緩，而懸浮藻對(duì)無(wú)機(jī)磷的去除率不斷增大。

藻類固定化以后，提高了對(duì)氨氮及無(wú)機(jī)磷的吸收，這主要是由于固定化藻類的生產(chǎn)和生理特征發(fā)生了變化[16-17]。一般認(rèn)為，固定化提高了藻類的合成代謝活性，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被充分吸收，提高了氨氮及無(wú)機(jī)磷的利用率。

2.2 懸浮藻與不同粒徑固定化藻球細(xì)胞生長(zhǎng)情況

從圖3可見，懸浮藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于固定化藻球細(xì)胞。不同粒徑固定化藻球細(xì)胞的生長(zhǎng)速度有差別，5 mm固定化藻球細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快，3 mm固定化藻球次之，4 mm固定化藻球最慢。這說(shuō)明固定化延緩了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，延長(zhǎng)了細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。Bailliez等[18]利用海藻酸鈣固定叢粒藻（Botryococcus braunnii），發(fā)現(xiàn)固定化藻的生長(zhǎng)速度略低于懸浮自由態(tài)藻，細(xì)胞形狀相同，大小約為懸浮藻的2.5倍。Robinson等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，CO2在載體中難以擴(kuò)散，使固定在載體中的細(xì)胞密集在載體膠珠的外圍，限制了固定化細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

2.3 不同投放率懸浮藻、固定化藻球與空白膠球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除效果

從圖4、5可知，固定化藻球、空白膠球及懸浮藻對(duì)海水養(yǎng)殖廢水中氨氮及無(wú)機(jī)磷的去除率差異極顯著（P<0.05）。固定化藻球試驗(yàn)組中，去除率差異不顯著（P>0.05），第1天去除率差別小，第2天和第3天對(duì)氨氮及無(wú)機(jī)磷的去除率差別較明顯，藻球投放量越多去除率越大，第4天、第5天對(duì)氨氮及無(wú)機(jī)磷的去除率逐漸達(dá)到飽和，15%固定化藻球去除率稍高，氨氮及無(wú)機(jī)磷最高去除效率分別達(dá)到95%、90%以上；空白膠球試驗(yàn)組與懸浮藻試驗(yàn)組中，不同投放量對(duì)氨氮的去除率無(wú)顯著性差異。由此可知，空白膠球本身對(duì)氨氮有一定的去除效果，去除率達(dá)到15%左右。藻細(xì)胞被固定化后，對(duì)養(yǎng)殖海水中氨氮的去除率顯著提高，而且投放量越多，去除效果越好。

研究發(fā)現(xiàn)，褐藻膠微觀結(jié)構(gòu)具有四通八達(dá)的網(wǎng)絡(luò)通道[20]，褐藻膠質(zhì)把細(xì)胞粘附在基質(zhì)表面，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于膠球內(nèi)小球藻對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，膠球內(nèi)細(xì)胞密度越高，對(duì)氮、磷的去除率越高。固定化會(huì)改變?cè)寮?xì)胞的生理特性和形態(tài)特征，張學(xué)成等[21]通過(guò)對(duì)固定化微藻的超微結(jié)果觀察，發(fā)現(xiàn)亞心型扁藻藻細(xì)胞比游離培養(yǎng)的細(xì)胞大，且外表粗糙，凹凸不平，推測(cè)是由于固定化培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞光合作用較強(qiáng)，而物質(zhì)能量消耗較低。Gonzalez等[22]研究發(fā)現(xiàn)，微藻固定化對(duì)藻類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝有影響。

3 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，固定化藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮和無(wú)機(jī)磷的去除率顯著高于懸浮藻，但藻細(xì)胞生長(zhǎng)被延緩。

固定化藻球粒徑的大小也會(huì)對(duì)氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除效果產(chǎn)生影響，一定粒徑大小時(shí)會(huì)促進(jìn)氮、磷的吸收，直徑過(guò)大或過(guò)小都會(huì)影響氮、磷的去除效果。直徑為4 mm的固定化藻球?qū)ＫB(yǎng)殖廢水中氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除率較高。

固定化藻類投放量的多少也會(huì)影響對(duì)氨氮、無(wú)機(jī)磷的去除效果，填充率為15%時(shí)去除效果更佳。

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