李冰冰，劉國(guó)峰，魏 書(shū)，黃龍全，張劍韻

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 2 30036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，安徽 合 肥230036）

煙草NtPLR1基因克隆與表達(dá)分析

李冰冰1，劉國(guó)峰1，魏 書(shū)1，黃龍全1，張劍韻2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 2 30036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，安徽 合 肥230036）

維生素B6（VB6）在植物體內(nèi)參與多種生化反應(yīng)，對(duì)植物生長(zhǎng)至關(guān)重要，吡哆醛還原酶（PLR）是VB6代謝轉(zhuǎn)換的作用酶，催化吡哆醛（PL）生成吡哆醇（PN），對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)VB6的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮重要作用，而PLR在植物中鮮有報(bào)道。以擬南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛還原酶氨基酸序列AtPLR1為模板，在公用數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)同源比對(duì)獲得數(shù)條煙草Nicotiana tabacum NtPLR1基因的片段，結(jié)合互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的末端快速擴(kuò)增-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RACE-PCR）技術(shù)獲得了煙草吡哆醛還原酶NtPLR1基因。該基因全長(zhǎng)1 370 bp，編碼369個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的分子量為41 kDa，理論等電點(diǎn)為9.42。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果表明：NtPLR1與其他物種的PLR1相似性較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析結(jié)果表明：外源吡哆醛PL處理時(shí)，NtPLR1表達(dá)先升高后降低，在4 d達(dá)到頂峰。相應(yīng)地，高效液相色譜分析結(jié)果表明：煙草葉片中PL含量隨時(shí)間逐漸降低而吡哆醇PN含量逐漸升高，表明NtPLR1可像酵母PLR一樣，催化PL形成PN。此外，定量分析結(jié)果表明：NtPLR1在煙草根、莖和葉片中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)顯著高于其他部位（P＜0.05）。在紫外線(xiàn)、氧化和鹽害脅迫下，NtPLR1的表達(dá)與對(duì)照相比均顯著上調(diào)（P＜0.05），表明NtPLR1對(duì)這3種逆境有響應(yīng)，可能參與煙草的抗逆過(guò)程。將NtPLR1連入原核表達(dá)載體pET32a，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功表達(dá)出目的蛋白。報(bào)道的煙草NtPLR1基因功能為進(jìn)一步探明植物PLR基因的功能和調(diào)控機(jī)制以及VB6的生物合成提供了重要參考。圖8表1參25

植物學(xué)；維生素B6；煙草；NtPLR1；基因克?。槐磉_(dá)分析

維生素B6（VB6）是一類(lèi)吡啶化合物的總稱(chēng)，包括吡哆醛（PL），吡哆醇（PN），吡哆胺（PM），磷酸吡哆醛（PLP），磷酸吡哆醇（PNP），磷酸吡哆胺（PMP）等，其中PLP是其主要活性形式，作為輔酶參與生物體內(nèi)100多種生化反應(yīng)，包括氨基酸代謝、抗生素合成、免疫調(diào)節(jié)等生理反應(yīng)及氧化脅迫等抗逆反應(yīng)［1］。細(xì)胞內(nèi)VB6各組分的平衡是機(jī)體進(jìn)行正常代謝的前提，因而VB6對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。研究［2］發(fā)現(xiàn)，自然界中VB6有從頭合成（de novo synthetic pathway）和補(bǔ)救合成（salvage pathway）2種方式，補(bǔ)救合成途徑使VB6異養(yǎng)型生物能夠利用外源攝入的PN，PM和PL來(lái)合成機(jī)體代謝所需要的活化型PLP并維持細(xì)胞各型VB6濃度相對(duì)穩(wěn)定。從頭合成已被廣泛研究，而補(bǔ)救合成途徑的研究卻相對(duì)缺乏。其中，吡哆醛還原酶（PLR）是VB6補(bǔ)救合成途徑中的作用酶，最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，屬于醛酮還原酶（aldo-keto reductase），在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在的條件下催化PL轉(zhuǎn)換成PN［3－4］，從而可維持細(xì)胞內(nèi)VB6動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于生物體進(jìn)行正常的生理活動(dòng)具有重要意義。植物性食物中VB6主要以PN或其糖基化形態(tài)存在，并推測(cè)植物中可能有高效的PN生成機(jī)制［5］。迄今為止，植物中只有擬南芥Arabidopsis thaliana的AtPLR1基因得到分離鑒定，對(duì)酵母突變體進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明AtPLR1像酵母PLR一樣，可催化PL形成PN［6］。T-DNA插入的Atplr1突變體根系生長(zhǎng)較野生型明顯緩慢，氯化鈉、甘露醇脅迫下Atplr1的生長(zhǎng)受到抑制［6］，推測(cè)PLR可能與植物抵抗鹽害和滲透壓脅迫有關(guān)。煙草Nicotiana tabacum是一種重要的模式植物及經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)其PLR進(jìn)行克隆和功能分析，有助于進(jìn)一步明確植物體內(nèi)VB6的補(bǔ)救合成途徑，同時(shí)為煙草良種選育提供理論儲(chǔ)備。本研究以AtPLR1為模板，經(jīng)過(guò)對(duì)美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列進(jìn)行比對(duì)和拼接并結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RACE-PCR）得到了煙草NtPLR1基因的全長(zhǎng)序列。以此為基礎(chǔ)，分析了其生物功能和表達(dá)特性，結(jié)果NtPLR1可催化PL形成PN。NtPLR1在葉片中表達(dá)最高，與紫外線(xiàn)、氧化及氯化鈉脅迫和外源PL處理有應(yīng)答反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

煙草 ‘云煙85’Nicotiana tabacum‘Yunyan 85’種子和pET32a原核表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)室保存。pEASY-Blunt載體、菌株BL21（DE3）Rosetta和大腸埃希菌Escherichia coli DH5α購(gòu)自TransGen公司。

1.2 處理方法

紫外線(xiàn)處理：在無(wú)菌操作臺(tái)上用紫外線(xiàn)照射生長(zhǎng)至旺長(zhǎng)期的煙草，照射時(shí)間分別為2 h，4 h和8 h，取莖尖以下的第3片葉，液氮冷凍，備用。

鹽處理：用100.0mmol·L－1的氯化鈉溶液澆灌旺長(zhǎng)期煙草，處理1 d，4 d和7 d后取樣，取莖尖以下第2片葉。液氮冷凍，備用。

氧化處理：澆灌亞硫酸氫鈉-亞硫酸鈉（NaHSO3-Na2SO3）混合物（10.0mmol·L－1，以亞硫酸鈉濃度計(jì)），處理1 d，4 d和7 d后取樣，取莖尖以下第2片葉，液氮冷凍，備用。

PL處理：將旺長(zhǎng)期煙草根部洗凈，置于添加100.0mg·L－1PL的水培液中，用錫紙將煙草根部及水培液遮住，莖葉接受正常光照。分別于培養(yǎng)的第2天、第4天和第8天采集莖尖以下第2片葉，液氮冷凍，備用。

以上均設(shè)置重復(fù)3個(gè)·處理－1。

1.3 總核糖核酸（RNA）提取及互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的合成

根據(jù)RNAiso Plus RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（Takara），進(jìn)行總RNA提取。提取的RNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度與完整性檢測(cè)。參照PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）對(duì)質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆及生物信息學(xué)分析

表1 NtPLR1基因克隆與表達(dá)分析所用引物信息Table 1 Primers used in NtPLR1 gene cloning and expression analysis

以擬南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）為模板，在煙草表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)里同源檢索，根據(jù)得到的EST序 列 ， 設(shè) 計(jì) 引 物 3RACE-1，3RACE-2，3RACE-3（表 1）進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增目的基因3′端序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，連接pEASY-Blunt載體后，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。3′端序列擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證后，使用DNAMAN軟件將它與EST起始序列結(jié)合得到全長(zhǎng)cDNA序列。隨后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物NtPLR-F1和NtPLR-R1（表1），擴(kuò)增NtPLR1序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3.0 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10.0 min。獲得的NtPLR1序列在NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST中進(jìn)行序列比對(duì)。用ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)分析該蛋白的分子量和等電點(diǎn)；采用DNAMAN 7.0軟件對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 NtPLR1表達(dá)特性分析

根據(jù)NtPLR1基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性定量引物（表1），以18 S rRNA為內(nèi)參基因，以根、莖、葉及紫外線(xiàn)、氧化、氯化鈉處理下不同時(shí)間點(diǎn)取樣葉片的cDNA為模板，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）分析。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃3.0 min，95℃10 s，55℃40 s，35個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)：從65℃ 按0.5℃/循環(huán)增加到95℃ 。以2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 VB6標(biāo)準(zhǔn)試劑的配制及VB6的色譜分析條件

VB6檢測(cè)參照張劍韻等［7－9］的方法，加以改進(jìn)。VB6色譜分析所用色譜柱為H&E公司的XPODS-A 5 μm 120 A（250.0mm×4.6mm）。高效液相色譜儀為Waters 600，配備2475熒光檢測(cè)儀。流動(dòng)相A（分析用）：體積分?jǐn)?shù)為1%乙腈（CH3CN）-25.0 mmol·L－1磷酸二氫鉀（KH2PO4）-25.0 mmol·L－1高氯酸鈉（Na-ClO4），pH 2.5；流速為0.5 mL·min－1。進(jìn)樣量均為5.0μL，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為395 nm，調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm。

1.7 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

原核表達(dá)載體構(gòu)建：根據(jù)載體pET32a多克隆位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)（Bam H1和Sal1）的原核表達(dá)引物（表1），以云煙85 cDNA為模板擴(kuò)增NtPLR1基因的cDNA片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶后，連接pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒小抽試劑盒（TransGen2）提取質(zhì)粒，即得到pEASY-NtPLR1載體。用限制性?xún)?nèi)切酶BamH1和Sal1雙酶切pEASY-NtPLR1和pET32a質(zhì)粒后進(jìn)行T4連接，即得到pET32a-Nt-PLR1重組質(zhì)粒。測(cè)序正確后，提取目的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）Rosetta菌株，即得到融合表達(dá)菌。

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：37℃培養(yǎng)融合表達(dá)菌至D（600）約為0.60，加入終濃度為1.0 mmol·L－1的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），并在18℃/37℃200 r·min－1誘導(dǎo)24 h。以含pET32a空質(zhì)粒的BL21（DE3）Rosetta為對(duì)照。離心收獲菌體，8 000 r·min－1離心10.0min，棄上清，用PBS重懸。重復(fù)1次后進(jìn)行超聲波破碎。分別取上清和沉淀，加入上樣緩沖液，沸水浴5.0 min，冷卻至室溫后，取20.0μL進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠，10%分離膠）電泳檢測(cè)。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、拍照，分析蛋白表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 Agorase gel electrophoresis results

2.1 NtPLR1克隆及氨基酸序列分析

以擬南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）為模板，在煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)里同源檢索到一條同源性（79%）序列（GenBank: HS082453.1）。以此EST序列為起點(diǎn)，進(jìn)行延伸檢索后得到4條候選EST序列，登錄號(hào)分別為GenBank:FS425789，GenBank:FS385536.1，GenBank:FS432618，GenBank:FS431044.1。使用DNAMAN比對(duì)5條EST序列，發(fā)現(xiàn)它們來(lái)源于同一基因，拼接后得到1條長(zhǎng)800 bp的起始序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)3輪3′-RACE引物（表1），進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增得到大小約為700 bp單一明亮條帶（圖1中泳道1）。將該條帶測(cè)序后和起始序列拼接得到全長(zhǎng)cDNA序列。隨后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物（表1），PCR擴(kuò)增得到大小約1 500 bp的序列（圖1中泳道2）。測(cè)序正確后，將此全長(zhǎng)序列命名為NtPLR1，其 cDNA長(zhǎng)度為1 370 bp，開(kāi)放閱讀框1 110 bp，5′非編碼區(qū)（UTR）長(zhǎng)55 bp，3′UTR長(zhǎng)205 bp。編碼369個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA（圖2），具有Aldo-keto還原酶家族保守底物結(jié)合位點(diǎn)［6］（圖2中下劃線(xiàn)強(qiáng)調(diào)部分）。在線(xiàn)預(yù)測(cè)其編碼蛋白的分子量為41 070.5 Da，理論等電點(diǎn)為9.42。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示，NtPLR1與AtPLR相似性為75%（圖3），與栗酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe［10］，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae［11］PLR的氨基酸相似性分別為24%和26%。

2.2 NtPLR1表達(dá)特性分析

分別提取煙草根、莖、葉的總RNA，D（260）/D（280）為1.9~2.0，表明RNA純度較好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖4A所示：NtPLR1在根、莖和葉均有表達(dá)，在葉中表達(dá)最高，根、莖表達(dá)水平較低。對(duì)不同逆境脅迫下NtPLR1的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：紫外線(xiàn)脅迫下，隨時(shí)間延長(zhǎng)，NtPLR1基因在煙草葉片中的表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，并在紫外線(xiàn)處理4 h時(shí)達(dá)到最大值（圖4B）。氧化及氯化鈉（100.0mmol· L－1）澆灌處理時(shí)，隨脅迫時(shí)間的增加，NtPLR1基因在煙草葉片中的表達(dá)持續(xù)升高，7 d時(shí)表達(dá)最高（圖4C）。在以上逆境脅迫下，NtPLR1表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，這表明NtPLR1與紫外線(xiàn)、氧化、氯化鈉脅迫有應(yīng)答反應(yīng)。

2.3 PL對(duì)NtPLR1表達(dá)的誘導(dǎo)效果及對(duì)PN生成量的影響

煙草水培液添加外源PL后，分別于培養(yǎng)的第2天、第4天、第8天取樣，分析NtPLR1基因的表達(dá)水平和PL，PN含量。定量PCR分析結(jié)果表明：NtPLR1表達(dá)隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第4天表達(dá)量達(dá)到最高，第2天、第4天、第8天的NtPLR1表達(dá)量分別是對(duì)照的2.20，2.85和1.50倍（圖5）。

VB6標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)結(jié)果如圖6A，峰型和區(qū)分度良好。對(duì)未處理的煙草葉片提取液分析發(fā)現(xiàn)，在PMP，PM，PLP，PL及PN的洗脫位置上均出現(xiàn)了相應(yīng)的洗脫峰（圖6B），說(shuō)明檢測(cè)方法可行。據(jù)此，對(duì)PL處理組煙草葉片進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明：隨時(shí)間延長(zhǎng)，處理組煙草葉片中PL含量逐漸降低，PN含量增幅明顯（圖7），同時(shí)，PMP，PM含量有小幅增長(zhǎng)，表明煙草吸收外源PL后，主要將PL轉(zhuǎn)化為PN。PL處理后NtPLR1的表達(dá)受到誘導(dǎo)，而在8 d時(shí)表達(dá)下降，結(jié)合PN，PMP和PM含量的逐漸增多可知，NtPLR1在煙草中催化PL形成PN。VB6各組分在煙草中動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，且各組分間存在反饋調(diào)節(jié)。

2.4 NtPLR1原核載體構(gòu)建及重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET32a-NtPLR1轉(zhuǎn)入BL21（DE3）Rosetta，分別在28℃和37℃條件下經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后，超聲波破碎菌體，離心分離上清和沉淀。將上清和沉淀分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)，結(jié)果顯示：上清中無(wú)目的條帶，而沉淀中在約53 kDa處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，因pET32a的組氨酸標(biāo)簽（his-tag）約為12 kDa，故蛋白條帶的大小與預(yù)期相符。僅沉淀中出現(xiàn)目的條帶，表明NtPLR1在大腸埃希菌中以包涵體形式存在（圖8）。

3 討論

VB6在自然界中廣泛地存在，主要以輔酶的形式參與生物體內(nèi)多種物質(zhì)代謝反應(yīng)，是生物機(jī)體內(nèi)很多重要酶系的輔酶［12］。植物體內(nèi)，VB6參與淀粉、亞油酸等物質(zhì)的合成［13］，對(duì)于生長(zhǎng)素、葉綠素以及乙烯的合成是不可或缺的［14－15］。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，VB6具有抗氧化作用，可猝滅超氧陰離子自由基及單線(xiàn)態(tài)氧［16］；除此之外，在低溫、滲透壓、鹽害、紫外及病菌等逆境中，VB6可以提高植株的抵抗力，發(fā)揮一定的抗逆作用［13，17－20］。

VB6從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑普遍存在于植物和微生物中［21－24］。植物和微生物是VB6自養(yǎng)生物，動(dòng)物自身無(wú)法從頭合成VB6，只能從食物中獲得VB6前體物質(zhì)，通過(guò)補(bǔ)救合成途徑滿(mǎn)足機(jī)體對(duì)VB6的需求。VB6補(bǔ)救途徑由多種酶參與，PLR是其中一種VB6補(bǔ)救合成酶，對(duì)于細(xì)胞進(jìn)行正常生理活動(dòng)具有重要意義。在研究擬南芥Atplr1時(shí)發(fā)現(xiàn)，Atplr1的VB6總水平下降，其中PL，PLP，PM和PMP水平顯著下降，而PN和PNP無(wú)顯著變化，推測(cè)在擬南芥內(nèi)可能存在PLR的同工酶［6］。而HUANG等［25］的研究認(rèn)為：煙草葉際PL—PN的轉(zhuǎn)換可能受葉際微生物的影響較大。VB6對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境適應(yīng)及人和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)具有重要意義，其從頭合成途徑已有較多的研究，而補(bǔ)救途徑還有許多不明之處，有待深入研究。本研究從煙草中克隆得到煙草NtPLR1，并設(shè)置了不同的逆境脅迫條件對(duì)NtPLR1進(jìn)行探究，結(jié)果表明：NtPLR1在葉中表達(dá)最高且受紫外線(xiàn)，氧化和氯化鈉脅迫的誘導(dǎo)，推測(cè)NtPLR1參與煙草植株對(duì)紫外線(xiàn)、氧化和氯化鈉脅迫的抗逆反應(yīng)。外源添加PL后，NtPLR1表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)，表明PL對(duì)NtPLR1有顯著的誘導(dǎo)作用。此外，外源PL處理的前4 d NtPLR1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而在培養(yǎng)的第8天時(shí)NtPLR1的表達(dá)降低，相應(yīng)的PL持續(xù)降低，而PN，PM和PMP等都有不同程度的升高，表明VB6各組分在煙草葉片中可相互轉(zhuǎn)化并存在反饋調(diào)節(jié)。目前，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行NtPLR1重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)及體外酶活測(cè)定，以期為進(jìn)一步探明煙草PLR基因功能及VB6補(bǔ)救合成過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

圖2 NtPLR1基因開(kāi)放閱讀框及預(yù)測(cè)氨基酸序列Figure 2 ORF of NtPLR1 gene and the corresponding amino acid sequence

圖3 幾個(gè)已知物種的PLR多序列比對(duì)Figure 3 Multiple protein sequence alignment of several known PLR enzymes

圖4 NtPLR1表達(dá)的組織特異性及對(duì)不同脅迫處理的響應(yīng)Figure 4 QPCR analysis of spatial expression of NtPLR1 and its response to different stress treatments

圖5 NtPLR1對(duì)外源PL處理的響應(yīng)分析Figure 5 QPCR analysis of the response of NtPLR1 to exogenous PL

圖6 HPLC分析VB6標(biāo)準(zhǔn)品（A）及對(duì)照煙草葉片提取液（B）Figure 6 HPLC analysis for VB6authentic standards（A）and extracts from control tobacco leaves（B）

圖7 HPLC分析外源PL處理組煙草葉片提取液Figure 7 HPLC analysis of extracts from exogenous PL treated tobacco leaves

圖8 NtPLR1在表達(dá)菌株BL21（DE3）Rosetta中的表達(dá)Figure 8 Prokaryotic expression of NtPLR1 in BL21（DE3）Rosetta

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Cloning and expression analysis of the tobacco NtPLR1 gene

LIBingbing1,LIU Guofeng1,WEIShu1,HUANG Longquan1,ZHANG Jianyun2
（1.School of Tea and Food Science,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China;2.School of Foreign Languages,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China）

Vitamin B6（VB6）,essential for plant growth and developmentand involved inmore than 100 biological processes,utilizes pyridoxal reductase （PLR）as the key enzyme in the VB6salvage pathway,thereby catalyzing pyridoxal（PL）to generate pyridoxine（PN）.Since studies on PLR of plant VB6are quite limited,PLR genes were cloned and characterized to improve understanding of VB6biosynthesis in plants.Several NtPLR1 gene fragments were found in Nicotiana tabacum through a homologous blast with Arabidopsis AtPLR1.Full length was obtained using rapid amplification of cDNA ends（RACE）.Real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR）and high performance liquid chromatography （HPLC）analysiswere conducted;NtPLR1 expression by ultraviolet,oxidation,exogenous PL,and NaCl treatments were compared to a control;and prokary otic expression of NtPLR1 was accomplished.Results of RACE showed that full length cDNA of NtPLR1 was 1 370 bp,which encoded 369 amino acid residueswith a proteinmolecular weight of about 41 kDa and a theoretical isoelectric point of 9.42.Real-time quantitative PCR analysis revealed that an exogenous PL treatmentinduced NtPLR1 expression with highest expression at 4 d.The HPLC analysis showed that PL content significantly decreased （P＜0.05）;whereas,PN content significantly increased （P＜0.05）during an exogenous PL treatment.NtPLR1 was expressed in roots,stems,and leaveswith leaves having the highest（P＜0.05）expression level.Also,ultraviolet,oxidation,and NaCl treatments,compared to a control,significantly induced （P＜0.05）NtPLR1 expression.Furthermore,prokaryotic expression of NtPLR1 in vector pET32a successfully revealed the recombinant protein at the expected size.This study reported the NtPLR1 gene of N.tabacum for the first time,finding that it catalyzed PL to form PN in tobacco as found in yeast,and itmay be induced in response to ultraviolet,oxidation,and NaCl stress;thus,the NtPLR1 gene can be an important reference for further plant PLR gene functional characterization and regulation as well as VB6biosynthesis.［Ch,8 fig.1 tab.25 ref.］

botany;vitamin B6;Nicotiana tabacum;NtPLR1;gene cloning;expression analysis

S572；S718.3

A

2095-0756（2017）04-0581-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.04.003

2016-08-30；

2016-10-27

安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（KJ2010A116）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31670297）

李冰冰，從事維生素B6代謝轉(zhuǎn)換研究。E-mail：lbb126@126.com。通信作者：張劍韻，教授，博士，從事維生素B6代謝和生物多樣性研究。E-mail：jianyun218@aliyun.com