李關(guān)艷，蘇有勇

(昆明理工大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，云南 昆明 650504)

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LC-MS法測定不同產(chǎn)地蛇足石杉石杉堿甲含量

李關(guān)艷，蘇有勇*

(昆明理工大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，云南 昆明 650504)

建立起一套基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)測定石杉堿甲(Hup A)含量的方法。樣品用1.5%CH3COOH提取總生物堿，在正離子模式下，采用離子監(jiān)測模式(SIM)檢測，定量分析離子為50～2 000m/z，在Agilent ZORBAX SB-C18平臺上(4.6 mm×250 mm)，流動相(體積比)為甲醇∶水(90∶10)，流速0.5 μL·min-1，檢測波長310 nm，柱溫28 ℃，進樣量10 μL。結(jié)果表明，在前述試驗條件下，Hup A在50～400 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 4)。利用該方法測定4產(chǎn)地蛇足石杉不同部位Hup A含量，結(jié)果顯示，蛇足石杉葉和莖中的含量均是云南(玻璃溫室種植)>江西>湖南>福建。

蛇足石杉； 石杉堿甲； LC-MS； 含量測定

蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev]，又名蛇足石松、千層塔、金不換，具有止血散瘀、消腫止痛、清熱除濕、解毒等功效，民間主要用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、內(nèi)傷出血、毒蟲叮咬、燒傷燙傷等癥[1-2]。自1972年中國首次報道該植物中所含的生物堿——石杉堿甲(Hup A)在動物試驗中有松弛橫紋肌的作用后，研究人員后續(xù)又發(fā)現(xiàn)Hup A是一種高效、低毒、可逆、高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于改善記憶力，治療重癥肌無力和老年性癡呆等疾病，并對抑制有機磷酸中毒有一定功效，其制劑哈伯因已在國內(nèi)上市，主要用于治療老年人記憶減退和早年癡呆等[3-5]。

國內(nèi)外研究學(xué)者對Hup A衍生物、類似物的合成及全合成做了眾多研究，但其合成步驟煩瑣、成本較高，且存在環(huán)境污染及難以獲得純光學(xué)活性合成物等問題，至今仍無法進行工業(yè)化生產(chǎn)[6-8]。也有學(xué)者基于內(nèi)生真菌與其共生宿主可以交換遺傳物質(zhì)這一理論，從野生蛇足石杉中分離純化內(nèi)生真菌獲得產(chǎn)石杉堿甲菌株，雖然從已分離獲得的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中能夠提取出與宿主植物相同的活性成分Hup A，但野生菌發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物中所含石杉堿甲量甚微，離工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲還有很大距離[9-13]。因此，Hup A的市場供給主要還是以自然資源為主，少量人工栽培。蛇足石杉在自然界中生長極其緩慢，其孢子約需15 a才能自然萌發(fā)[14]，而且由于其生長環(huán)境因子不同，不同生長地點的蛇足石杉中Hup A含量亦不同，導(dǎo)致不同產(chǎn)地原材料質(zhì)量參差不齊。本研究擬建立起一套基于HPLC-MS直接測定蛇足石杉中Hup A含量的方法，并利用該方法對比了不同生長地蛇足石杉不同部位中Hup A的含量，以期為蛇足石杉植物資源的采摘、栽培以及蛇足石杉質(zhì)量控制和評估提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

Agilent 1100 LC/MS Series Trap SL系統(tǒng)，美國Agilent公司；色譜柱，ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HHS數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；微型植物試樣粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；旋蒸儀，EYELA倍捷科技；循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 材料

蛇足石杉對照品購買于國家標(biāo)準(zhǔn)品對照品供應(yīng)站，Hup A對照品經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于97.0%。本試驗所用的云南蛇足石杉成株，于2014年9月至2016年6月種植在昆明理工大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程試驗性玻璃溫室，湖南蛇足石杉于2016年6月采購于湖南省保靖縣白云山，福建蛇足石杉于2016年6月采購于福建省南平市政和鎮(zhèn)，江西蛇足石杉于2016年6月采購于江西省宜春市宜豐縣。甲醇為進口色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，氨水、氯仿、冰醋酸均為分析純。

1.3 測定波長的確定

石杉堿甲結(jié)構(gòu)優(yōu)化采用B3LYP/6-311++G(d,p)方法與基組，將此結(jié)構(gòu)作為激發(fā)態(tài)輸入文件，在TDDFT/B3LYP/6-311++G(d,p)方法與基組下計算50個激發(fā)態(tài)分子軌道躍遷能量，所得計算值采用函數(shù)擬合。計算結(jié)果表明，該分子在297 nm左右有較大的紫外吸收。根據(jù)此數(shù)據(jù)，設(shè)定280、290、300、310 nm波長進行測定分析。結(jié)果顯示，在波長310 nm下，能有效減少樣品中其他成分的干擾，其靈敏度和響應(yīng)值最大，因此，后期檢測波長采用310 nm。

1.4 色譜條件

Agilent 色譜柱；流動相為甲醇：水，體積比90:10，流速0.5 μL·min-1；檢測波長310 nm；柱溫28 ℃；進樣量10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

ESI離子源，離子阱質(zhì)量分析器；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量9 L·min-1；噴霧壓力35 psig(英制單位，儀器設(shè)定需要，1 psi=6.894 76 kPa)；毛細(xì)管電壓3 500 V。在正離子模式下，采用選擇離子監(jiān)測模式(SIM)檢測，其定量分析離子為m/z50～2 000。

1.6 對照品溶液的制備

精密稱重Hup A對照品8 mg，用甲醇定容至20 mL，配制成濃度為400 μg·mL-1的石杉堿甲對照儲備液，再分別稀釋成50、100、160、200 μg·mL-1的對照品溶液，封口置于4 ℃冰箱，臨用放置至室溫。

1.7 供試品溶液的制備

為不同產(chǎn)地的新鮮蛇足石杉植株編號，用流動水洗凈根部泥土，洗凈的植物樣品置于50 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎并精確稱重后置于100 mL三角燒瓶中，加入1.5% CH3COOH，料液比1∶10，冷浸12 h，超聲45 min(水溫45 ℃，功率80%)，冷卻后過濾。濃氨水堿化至pH值9，氯仿萃取3次，每次200 mL，合并氯仿提取液回收至干，甲醇溶解后定容至5 mL，取1 mL溶液過0.45 μm有機濾頭，置于液相瓶中以備分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理及分析

應(yīng)用SPSS 17.0的ANOVA過程進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan法(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件進行測定，采用外標(biāo)法進行定量，對照品及樣品的檢測譜圖分別見圖1、圖2?？梢娫谠囼炘O(shè)定條件下，各成分分離效果良好，峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象。對照品及樣品中Hup A的保留時間分別為9.487、9.793 min，m/z=243為Hup A的[M+H]+峰，整個分離過程只需11 min。

圖1 Hup A對照品(左)和樣品(右)色譜圖

圖2 Hup A對照品(左)和樣品(右)MS譜圖

2.2 測定方法的線性關(guān)系

按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件分析5組濃度的對照品溶液(50、100、160、200、400 μg·mL-1)，以峰面積為縱坐標(biāo)y，Hup A濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)x進行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=27.192x+16.283(R2=0.999 4)，在50～400 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 測定方法的精準(zhǔn)度

取400 μg·mL-1的Hup A對照品溶液，按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件，重復(fù)進樣5次，測得Hup A峰面積的變異系數(shù)(RSD)為0.71%，表明儀器的精密度良好。

取玻璃溫室種植蛇足石杉全株，按1.7節(jié)設(shè)定的條件提取，按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件進行測定，重復(fù)5次，Hup A峰面積的RSD為1.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

取4產(chǎn)地的蛇足石杉樣品，按1.7節(jié)方法制備成溶液后，分別放置1、3、5、8、12 h，依照1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件進行測定。在12 h內(nèi)，4個產(chǎn)地樣品溶液中Hup A峰面積的RSD(n=3)分別為：玻璃溫室0.63%，湖南0.77%，福建0.87%，江西0.62%，表明供試樣品中的Hup A在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

取400 μg·mL-1的Hup A對照品溶液0.3 mL加入0.7 mL的樣品提取液中，按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件測定，計算Hup A的含量，計算加樣回收率。結(jié)果詳見表1?？梢钥闯?，樣品的回收率整體較高，在94.74%～98.06%，且變異系數(shù)在1.67%～1.91%。

2.4 不同產(chǎn)地樣品Hup A含量對比

按1.4、1.5節(jié)設(shè)定的條件，采用外標(biāo)法進行定量，4個產(chǎn)地蛇足石杉中Hup A在莖、葉中的含量見圖3?？梢钥闯?，不同栽培環(huán)境對蛇足石杉藥用成分Hup A含量具有顯著影響。蛇足石杉葉片中Hup A的含量以種植于溫室大棚的樣品最高，且顯著(P<0.05)高于其他樣品，福建樣品葉片中Hup A的含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他樣品。蛇足石杉莖中Hup A的含量以種植于溫室大棚與江西樣品最高，且顯著(P<0.05)高于其他樣品，福建樣品莖中Hup A的含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他樣品?？傮w來看，Hup A在蛇足石杉葉和莖中的含量均是云南(玻璃溫室種植)>江西>湖南>福建。

表1 回收率試驗的結(jié)果

柱上標(biāo)有不同大、小寫字母的分別表示各產(chǎn)地蛇足石杉莖與葉片中含量差異顯著(P<0.05)圖3 不同產(chǎn)地蛇足石杉樣品中的Hup A含量

3 小結(jié)與討論

不同的化合物各自都對應(yīng)有最大紫外吸收波長，只有在最大紫外吸收波長下，才能獲得最大的響應(yīng)值[15]。Hup A結(jié)構(gòu)優(yōu)化采用B3LYP/6-311+++G(d,p)方法與基組，理論測算顯示，該分子在297 nm有較大的紫外吸收，實測結(jié)果310 nm，與理論值十分接近且誤差在15 nm之內(nèi)，表明該理論測算方法具有較強的指導(dǎo)意義。

先前的研究多采用HPLC法對蛇足石杉植株的Hup A等生物堿進行分離檢測，本試驗首次使用LC-MS法對蛇足石杉植株的Hup A進行檢測，結(jié)合離子荷質(zhì)比可以更準(zhǔn)確地確定Hup A的分離情況。相比袁經(jīng)權(quán)等[16]、杜次等[17]的試驗結(jié)果，本試驗條件下各成分分離效果良好，峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象，整個分離過程只需11 min，洗脫時間更少，且避免了使用毒性較高的乙腈洗脫試劑和酸性溶液，有助于保護試驗人員和分析儀器。

蛇足石杉生長范圍廣，環(huán)境因子對其Hup A含量影響較大[18]，相比袁經(jīng)權(quán)等[16]報道的Hup A含量(廣西龍勝縣蛇足石杉，莖中含量0.018 0%、葉中0.035 9%)，本試驗中溫室大棚種植的蛇足石杉莖(0.044 4%)葉(0.055 9%)部位中Hup A的含量更高，與杜次等[17]描述的湘西鳳凰兩頭羊產(chǎn)地蛇足石杉莖葉中Hup A含量(0.043 8%、0.055 2%)相差不多。在生物堿的提取過程中，浸泡溫度、浸泡時間、酸化程度、溶劑選擇、提取手段、pH值以及萃取次數(shù)等都會對生物堿的提取率造成一定的影響。本試驗在傳統(tǒng)提取手段中加入超聲波協(xié)助溶劑提取，通過控制溫度、超聲時間等措施，有助于提高生物堿的提取率。

總體來看，本試驗所采用的基于LC-MS測定蛇足石杉中Hup A含量的方法快速，簡便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為蛇足石杉植物資源的采摘、規(guī)?；耘嘁约百|(zhì)量控制和評估等提供新的參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：高 峻)

2017-02-09

李關(guān)艷(1991—)，女，云南昭通人，碩士，研究方向為藥用植物種苗繁育， E-mail：1319048359@qq.com。

蘇有勇(1969—)，男，云南昆明人，教授，博士，研究方向為生物質(zhì)能，E-mail：497611561@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170729

Q946.88

A

0528-9017(2017)07-1186-04

注：衷心感謝中科院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室周俊課題組提供試驗儀器。

文獻(xiàn)著錄格式：李關(guān)艷，蘇有勇. LC-MS法測定不同產(chǎn)地蛇足石杉石杉堿甲含量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(7)：1186-1189.