葉立娜，陳力，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點實驗室，上海 200032

·綜述·

葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)

葉立娜，陳力，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點實驗室，上海 200032

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/ CRISPR-associated protein， CRISPR/Cas〕是原核生物在進(jìn)化過程中形成的獲得性免疫系統(tǒng)，能抵抗噬菌體、質(zhì)粒及可移動遺傳因子等外源性DNA或RNA的入侵。目前，在多種葡萄球菌基因組中均發(fā)現(xiàn)CRISPR序列存在，其間隔序列通常與葡萄球菌的噬菌體或接合性質(zhì)粒具有同源性，可能對葡萄球菌的毒力、耐藥性傳遞和生物膜形成等生理學(xué)特性有影響。本文在簡單介紹細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的構(gòu)成、防御機(jī)制等進(jìn)行綜述。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白；葡萄球菌；外源性核酸；噬菌體

近年來發(fā)現(xiàn)，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas〕是細(xì)菌的一種免疫系統(tǒng)，主要防御外源性核酸如噬菌體或質(zhì)粒等的入侵。CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用與限制修飾(restriction-modification，R-M )及DNA磷硫酰化修飾系統(tǒng)相似，均以識別外源性DNA為基礎(chǔ)[1]；其中CRISPR/Cas系統(tǒng)通過對入侵基因的免疫記憶識別外源性DNA或RNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)的記憶產(chǎn)生是通過外源性核酸的短核苷酸序列作為間隔序列插入CRISPR位點，轉(zhuǎn)錄后識別再次入侵的外源性DNA或RNA[2]，因此CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種獲得性免疫系統(tǒng)。金黃色葡萄球菌是易產(chǎn)生耐藥性的重要致病性球菌，而表皮葡萄球菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染及生物膜相關(guān)疾病的重要機(jī)會致病菌，易被噬菌體侵襲或外源基因轉(zhuǎn)入。隨著表皮葡萄球菌RP62A基因組中CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)(2005年)[3]，多個課題組對葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的特性開展了研究。本文重點介紹葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)。

1 細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR/Cas9作為簡單、快速、高效的基因編輯工具，已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠及細(xì)菌的基因組精確修飾，其在基因工程領(lǐng)域尤其是動物模型的構(gòu)建中具有廣闊應(yīng)用前景，并有望為血液病、腫瘤及其他遺傳疾病提供新的治療手段。

在已解析的細(xì)菌基因組中，84%的古細(xì)菌和47%的真細(xì)菌具有CRISPR/Cas系統(tǒng)，多位于染色體上，僅少部分存在于質(zhì)粒(如硫化葉菌)(CRISPRdb，http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr)[4-5]。CRISPR/Cas系統(tǒng)由前導(dǎo)序列(leader)、CRISPR序列和多個cas基因組成。CRISPR 是一類結(jié)構(gòu)特殊的重復(fù)序列，由21～48 bp的同向重復(fù)序列和間隔序列組成。間隔序列的大小與重復(fù)序列相似。重復(fù)序列通常呈回文序列，起始于GTTT，終止于GAAAC[6]，轉(zhuǎn)錄后可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。間隔序列大多與入侵質(zhì)?；蚴删w的基因組序列具有同源性。在CRISPR位點上游有一段20～534 bp富含AT的前導(dǎo)區(qū)，而CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的啟動子就位于前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。另外，新間隔序列的插入位點往往位于前導(dǎo)區(qū)與第1個重復(fù)序列之間，提示前導(dǎo)序列可能與間隔序列的插入有關(guān)，也有研究證實了前導(dǎo)區(qū)的DNA片段在外源基因獲取中的作用[7]。CRISPR/Cas系統(tǒng)通常包含4～20個不同的cas基因[8]，位于CRISPR位點的上游或下游，其編碼的Cas蛋白在外源性核酸入侵防御過程中起重要作用。Cas1、Cas2蛋白在新間隔序列插入時發(fā)揮作用，而其他Cas蛋白的基序相差很大，在各防御階段行使不同功能。

1.1 細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的分型

在噬菌體及其他外源遺傳因子的選擇壓力下，細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)不斷進(jìn)化演變，導(dǎo)致菌種內(nèi)和菌種之間CRISPR/Cas系統(tǒng)的數(shù)量和功能呈現(xiàn)多樣性[9]。根據(jù)CRISPR位點結(jié)構(gòu)、cas基因庫和免疫作用機(jī)制的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為Ⅰ～Ⅴ 5個型別，并進(jìn)一步劃分為16個亞型(表1)[10]。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均有其特有的cas基因，分別為cas3、cas9和cas10。葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)歸類于Ⅲ型[10]。Ⅳ型和Ⅴ型是新發(fā)現(xiàn)的型別，其功能與作用機(jī)制尚不清楚。

1.2 細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制

CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源性DNA發(fā)揮防御作用分3個階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾階段，整個過程由Cas蛋白和CRISPR RNA(crRNA)共同參與(圖1)。適應(yīng)階段(外源性核酸獲取階段)：在Cas1和Cas2蛋白的參與下，外源性核酸的原型間隔序列(proto-spacer)插入細(xì)菌的CRISPR位點中，形成一個新的帶有免疫記憶和遺傳性的間隔序列，從而獲得對同種外源性核酸再次入侵的抵抗力[2]。表達(dá)階段(crRNA合成階段)：先由CRISPR序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一段長的crRNA前體(precursor crRNA，pre-crRNA)，通過進(jìn)一步剪切，處理成僅包含一個間隔序列的成熟crRNA，其兩端帶有部分重復(fù)序列[11-12]。在大多數(shù)Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，crRNA合成依賴Cas6蛋白家族參與，在重復(fù)序列的特定位點對pre-crRNA進(jìn)行識別和剪切[11]；而Ⅱ型系統(tǒng)是利用反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)及宿主編碼的核糖核酸酶Ⅲ(ribonuclease Ⅲ，RNase Ⅲ)來對pre-crRNA進(jìn)行處理[12]。干擾階段(攻擊階段)：crRNA作為引導(dǎo)序列，在Ⅱ型系統(tǒng)中與tracrRNA和具有多個功能域的Cas9結(jié)合[13]，在Ⅰ、Ⅲ型系統(tǒng)中與多個Cas蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白效應(yīng)復(fù)合物[14]。crRNA通過堿基配對識別再次入侵的靶核酸，介導(dǎo)Cas蛋白對其進(jìn)行切割和降解。雖然不同型別CRISPR系統(tǒng)的核糖核蛋白效應(yīng)復(fù)合物的組成成分和核酸剪切機(jī)制不同，但Ⅰ和Ⅱ型效應(yīng)復(fù)合體可抵御外源性DNA入侵[13,15]，Ⅲ型對DNA和RNA均有防御作用[16-17]。研究顯示，Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅具有抗病毒的免疫功能，還能抵抗基因的水平轉(zhuǎn)移，如抵抗接合性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移[16]和外源性DNA的自然轉(zhuǎn)化[18]。然而，致病菌的毒力和耐藥性的水平轉(zhuǎn)移及噬菌體的入侵對CRISPR/Cas系統(tǒng)也存在免疫逃逸，前者是基于質(zhì)粒及輔助遺傳因子的選擇作用，涉及宿主自身CRISPR 位點或間隔序列的修飾或刪除[9]， 而后者與噬菌體靶基因的變異有關(guān)[19]。

表1 細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的分型

Tab.1 The classification of bacterial CRISPR/Cas systems

TypesSignatureproteinsSubtypesSignatureproteinsRepresentativestrainsⅠCas3ⅡCas9ⅢCas10ⅣCsf1ⅤCpf1Ⅰ-ACas8a,Csa5ArchaeoglobusfulgidusⅠ-BCas8bClostridiumkluyveriDSM555Ⅰ-CCas8cBacillushaloduransC-125Ⅰ-DCas10dCyanothecesp.PCC8802Ⅰ-ECse1,Cse2EscherichiacoliK12Ⅰ-FCsy1,Csy2,Csy3,Cas6fYersiniapseudotuberculosisYPIIIⅠ-UGSU0054GeobactersulfurreducensⅡ-ACsn2StreptococcusthermophilusCNRZ1066Ⅱ-BCas4Legionellapneumophilastr.ParisⅡ-C—*Neisserialactamica020-06Ⅲ-ACsm2StaphylococcusepidermidisRP62AⅢ-BCmr5PyrococcusfuriosusDSM3638Ⅲ-CMTH326Methanothermobacterthermautotrophicusstr.DeltaHⅢ-DCsx10Roseiflexussp.RS-1——AcidithiobacillusferrooxidansATCC23270——Francisellacf.novicidaFx1

*Only three genes are present in the Ⅱ-C operon:cas1,cas2,cas9.

目前，表皮葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci，CoNS)引起的醫(yī)院內(nèi)感染(包括細(xì)菌生物膜相關(guān)疾病)日趨增多[20]。由于基因操作技術(shù)困難，對CoNS致病性相關(guān)基因及其功能的研究受到限制，推測其與細(xì)菌存在CRISPR/Cas等防御外源性DNA入侵的系統(tǒng)有關(guān)。葡萄球菌可通過基因水平轉(zhuǎn)移獲取毒力因子，噬菌體在其中發(fā)揮重要作用[21-22]?？股氐膹V泛使用導(dǎo)致多重耐藥菌株出現(xiàn)，與細(xì)菌獲取攜帶耐藥基因的接合性質(zhì)粒密切相關(guān)[3]。CRISPR/Cas系統(tǒng)可抵抗此類外源性基因的水平轉(zhuǎn)移，分析致病性葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的間隔序列與噬菌體和質(zhì)粒的同源性，預(yù)測其攜帶的毒力和耐藥基因，可為細(xì)菌致病性研究及抗菌藥物的選擇提供依據(jù)。

2 葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)

Gill等于2005年對表皮葡萄球菌RP62A基因組分析時，首次發(fā)現(xiàn)其存在CRISPR序列[3]。Marraffini等于2008年發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌RP62A的CRISPR/Cas系統(tǒng)限制外源性質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移[16]。CRISPRdb[4](http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/)最新數(shù)據(jù)顯示，在已解析的55株葡萄球菌菌株中，37株菌株共存在51個CRISPR序列，其中32株是金黃色葡萄球菌，1株是表皮葡萄球菌(RP62A，ATCC 35984)，4株是其他種類的葡萄球菌。表皮葡萄球菌ATCC 12228株基因組中僅發(fā)現(xiàn)了CRISPR的可疑結(jié)構(gòu)(questionable structure)。Yang等對其中32株金黃色葡萄球菌的45個CRISPR序列進(jìn)行分析，僅有兩株菌(08BA02176和MSHR1132)具有cas基因[22]。鑒于表皮葡萄球菌RP62A的CRISPR/Cas系統(tǒng)中間隔序列與所有已測序的葡萄球菌(包括醫(yī)院和社區(qū)獲得性的耐甲氧西林和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌)的接合性質(zhì)粒中nickase(nes)基因具有同源性[3,23-25]，其在抵抗耐藥性傳播中具有重要意義。本文主要以表皮葡萄球菌RP62A為例，介紹葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)。

根據(jù)葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)所含的csm基因(Cas subtypeM.tuberculosisgene)， 可將其歸類于Ⅲ-A型[10]。Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅲ-A、Ⅲ-B、Ⅲ-C、Ⅲ-D 4個亞型，均具有cas10基因，其編碼的蛋白Cas10與輔助基因(csm或cmr)編碼的蛋白構(gòu)成Cas10-輔助蛋白復(fù)合體[26]。輔助基因中，csm為Ⅲ-A、Ⅲ-D型CRISPR/Cas系統(tǒng)所特有，csm2為其標(biāo)志基因；而cmr為Ⅲ-B、Ⅲ-C型所特有，cmr5為其標(biāo)志基因[10]。Ⅲ-A型的Cas10-Csm復(fù)合物主要攻擊外源性DNA，但在少數(shù)細(xì)菌中可作用于RNA(如嗜熱鏈球菌[27])，且兩者剪切外源性核酸的過程也不相同，由Cas10-Csm復(fù)合物中不同的活性區(qū)所催化[28]。ⅢB型的Cas10-Cmr復(fù)合物主要攻擊外源性RNA[10]。

The adaptation, expression and interference mechanisms of staphylococcal CRISPR/Cas systems. The leader (gray boxes) provides locus for integration of the proto-spacer and contains transcriptional promoter for CRISPR sequence. The repeats (yellow diamonds) and spacers (colored rectangles) are transcribed as a long precursor crRNA, and are processed as several short mature crRNAs by specific Cas-Csm proteins (colored pies). The spacers within the mature crRNAs guide Cas10-Csm effector complexes to recognize exogenous nucleic acids by matching the nucleotides, which is followed by cleavages and degradations of the targets.

圖1 葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御機(jī)制

Fig.1 Defensive mechanisms of staphylococcal CRISPR/Cas systems

2.1 葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成

利用CRISPRfinder[4](http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)和美國國立生物技術(shù)信息 中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析金黃色葡萄球菌MSHR1132和08BA0217的CRISPR/Cas系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其不同于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas系統(tǒng)，含有兩個CRISPR序列(圖2A、2B)。在利用BLAST對金黃色葡萄球菌08BA0217的重復(fù)序列進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)了與其含有相同重復(fù)序列的金黃色葡萄球菌JS395，而在對JS395基因組進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)其具有完整的CRISPR/Cas系統(tǒng)(圖2C)，與Cao等的描述結(jié)果一致[29]。

分析表皮葡萄球菌RP62A的CRISPR/Cas系統(tǒng)，結(jié)果與Marraffini等的描述結(jié)果相同[16]。CRISPR序列中含3個間隔序列(spa1、spa2和spa3)(圖2D)：spa1與目前已測序的葡萄球菌質(zhì)粒具有不同程度的同源性，其中同源性為100%的質(zhì)粒有20種(表2)；spa2與表皮葡萄球菌的噬菌體具有不同程度的同源性，其中與葡萄球菌噬菌體PH15[21]具有100%同源性；而spa3在NCBI數(shù)據(jù)庫中未找到同源性基因。

The CRISPR loci ofStaphylococcusaureussubsp.aureusMSHR1132 (A),Staphylococcusaureus08BA0217 (B),StaphylococcusepidermidisRP62A (D) were found in CRISPRs database (http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/), while that ofStaphylococcusaureussubsp.aureusJS395 (C) was identified by BLAST against the repeat sequence ofStaphylococcusaureus08BA0217. The arrangements of repeats (yellow diamonds), spacers (colored rectangles), CRISPR-associated genes andcassubtypeM.tuberculosis(csm) genes (colored pentagons) of the four strains are shown according to their genomic graphics in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The repeat sequence of each CRISPR locus is also presented.

圖2 葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

Fig.2 Structures of staphylococcal CRISPR/Cas systems

葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)包含9個cas-csm基因(圖2)，其在金黃色葡萄球菌MSHR1132、08BA0217和JS395中位于兩個CRISPR序列之間，而在表皮葡萄球菌RP62A中位于CRISPR位點下游。其中cas1和cas2在噬菌體或質(zhì)粒入侵時對其間隔序列的獲取發(fā)揮作用[30]，其他7種基因作用于防御過程。Cas10(又稱Csm1)是Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征性蛋白，也是Ⅲ型效應(yīng)復(fù)合物中的最大亞單位[26]。Csm3、Csm4、Csm5和Cas6均屬于RAMP超級家族[8]，該家族的蛋白在Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中分布廣泛。Cas10、 Csm2、Csm3、Csm4和Csm5參與crRNA成熟和Cas10-Csm核糖核蛋白復(fù)合物的形成[26]，其中Cas10、Csm3和 Csm4在聚集蛋白形成復(fù)合物中起重要作用[31]。

2.2 葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源性核酸的防御機(jī)制

葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御過程與其他CRISPR/Cas系統(tǒng)一樣，分3個階段，且在適應(yīng)階段均以Cas1和Cas2發(fā)揮外源性核酸的獲取作用。然而，在表達(dá)和干擾階段，葡萄球菌對外源性核酸的防御作用機(jī)制較為復(fù)雜，區(qū)別于Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，詳見表3。

在crRNA表達(dá)階段，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成 pre-crRNA后的處理過程對靶基因的識別和剪切至關(guān)重要，因其作用位點在離成熟crRNA末端特定距離處[17]，且多余的側(cè)翼片段可能增加與靶基因同源的機(jī)會而阻礙免疫識別作用。在表皮葡萄球菌RP62A CRISPR/Cas系統(tǒng)的crRNA表達(dá)過程中，pre-crRNA處理過程分為初步處理和成熟兩個階段(圖1)。在pre-crRNA初步處理階段，Cas6將pre-crRNA剪切成71個核苷酸(nucleotide，nt)的crRNA中間體[26]，包含一個完整的34～44 nt間隔序列，其5′端是來自重復(fù)序列3′端8 nt片段(稱為crRNA tag)，3′端是來自重復(fù)序列5′端的15～16 nt殘余片段[32]。Cas6是RAMP家族的一種內(nèi)切核糖核酸酶[8]，對重復(fù)序列具有特異性。Ⅲ-A型系統(tǒng)的Cas6在pre-crRNA的初步處理過程中單獨作用，無其他Cas蛋白參與[26,31]，而大多數(shù)Ⅰ型系統(tǒng)中的Cas6與其直系同源物(orthologue)形成識別效應(yīng)復(fù)合物共同作用[33-34]。與此不同，Ⅱ型系統(tǒng)pre-crRNA的初步處理由tracrRNA與pre-crRNA互補而介導(dǎo)[12]。在crRNA成熟階段，Ⅲ-A型CRISPR/Cas系統(tǒng)的Csm2、Csm3、Csm5與crRNA中間體聚集，Csm3在crRNA中間體3′端以6 nt為單位進(jìn)行度量，由Csm2、Csm3和Csm5共同作用將多余重復(fù)序列切除，形成31～67 nt的成熟crRNA[26]，并與Csm4和Cas10結(jié)合，共同形成穩(wěn)定的Cas10-Csm核糖核蛋白效應(yīng)復(fù)合物[26,31]。Ⅱ型系統(tǒng)的crRNA成熟剪切位點在crRNA中間體5′端[12]，而Ⅰ型系統(tǒng)無該成熟階段[35-36]。

表2 表皮葡萄球菌RP62A基因組 CRISPR中spa1的100%同源性質(zhì)粒

Tab.2 Plasmids homologous to spa1 in the CRISPR locus ofS.epidermidisRP62A with 100% identity

PlasmidsBacteriaStrainsReferencespT33G-1S.lugdunensisTLUG033G-4Ho,2016pK93GS.lugdunensisKLUG093G-4Ho,2016pT15G-1S.lugdunensisTLUG015G-4Ho,2016pKM01S.pseudintermediusHK547/11Calcutt,2015pMIS.aureusMIKatayama,2016pGO400S.aureusRN4220Ray,2015pRM27S.aureusRN4220Ray,2015pN315GS.aureusN315GZhang,2012pI5S5S.aureusST228Vogel,2012SAP082AS.aureusCDCPANICUMcDougal,2010SAP080AS.aureusCDCTN147McDougal,2010SAP079AS.aureusCDCGA672McDougal,2010SAP069AS.aureusPM79Summers,2009SAP068AS.aureusPM64Summers,2009SAP014AS.aureusCDC58Summers,2009SAP015BS.aureusCDC61Summers,2009pUSA03S.aureusUSA300_FPR3757Diep,2006pLW043S.aureus—*Weigel,2003pGO1S.aureus4220Climo,1996pSK41S.aureus—*Firth,1993

*The strain is not mentioned in the nucleotide database of NCBI.

表3 葡萄球菌Ⅲ-A型CRISPR/Cas系統(tǒng)與Ⅰ、Ⅱ型系統(tǒng)防御機(jī)制的比較

Tab.3 Comparison of defensive mechanisms among Ⅲ-A and Ⅰ/Ⅱ CRISPR/Cas systems

CRISPR/Cas 系統(tǒng)型別crRNA表達(dá)階段crRNA初步處理crRNA的成熟靶核酸干擾階段靶向選擇剪切機(jī)制Ⅲ-A型系統(tǒng)Cas6與同源物形成復(fù)合物共同作用Csm2、Csm3、Csm5參與,剪切crRNA3'端要求crRNAtag與靶核酸的5'端側(cè)翼序列不具有同源性需外源性DNA轉(zhuǎn)錄,Cas10-Csm剪切DNA和mRNAⅠ型系統(tǒng)Cas6單獨作用無此過程識別前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer-adjacentmotif,PAM)Cas3、Cas9直接剪切外源性DNAⅡ型系統(tǒng)tracrRNA介導(dǎo)RNase剪切crRNA 5'端

在靶核酸干擾階段，葡萄球菌對外源性DNA的識別和剪切機(jī)制亦不同于Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)(表3)。除crRNA與外源性DNA配對外，葡萄球菌Ⅲ-A型CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向選擇還有特殊要求，以區(qū)分外源性DNA與自身CRISPR。當(dāng)crRNA tag與靶核酸5′端側(cè)翼序列不具有同源性時，靶核酸被識別為外源性核酸；而crRNA tag與自身CRISPR的部分重復(fù)序列完全配對時，自身核酸被識別，以防止自身免疫[37]。因此，當(dāng)crRNA tag與外源性核酸5′端側(cè)翼序列具有完全同源性時，可出現(xiàn)免疫逃逸。噬菌體和質(zhì)粒對CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫逃逸機(jī)制可能成為葡萄球菌致病性基因水平轉(zhuǎn)移的有利條件。此外，葡萄球菌Ⅲ-A型系統(tǒng)Cas10-Csm復(fù)合物剪切外源性DNA需特殊條件：在外源性DNA轉(zhuǎn)錄后，由Cas10-Csm復(fù)合物的不同活性區(qū)分別對DNA和轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行剪切[28]，而Ⅰ、Ⅱ型系統(tǒng)則分別由Cas3、Cas9蛋白直接行使對外源性DNA的剪切功能[38-39]。

3 結(jié)語

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物在進(jìn)化過程中形成的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，除能抵抗病毒侵襲外，還能阻止質(zhì)?；蚱渌z傳因子的水平轉(zhuǎn)移，主要取決于間隔序列與外源性核酸的同源性。葡萄球菌具有Ⅲ-A型CRISPR/Cas系統(tǒng)，包含9個cas-csm基因，其間隔序列通常與噬菌體和質(zhì)粒的基因具有同源性，表明這些外源性基因的不斷入侵在葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)化過程中起重要作用。鑒于葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)可抵抗毒力及耐藥性相關(guān)外源性基因的水平傳播，其間隔序列的生物信息學(xué)分析對選擇臨床用藥具有重要指導(dǎo)意義?；谫|(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基因操作在很多CoNS中常常失敗，推測可能與細(xì)菌存在CRISPR/Cas系統(tǒng)等防御外源性DNA入侵的遺傳屏障有關(guān)。因此，研究葡萄球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源性核酸轉(zhuǎn)移的免疫作用及機(jī)制，通過改造CRISPR/Cas系統(tǒng)用于葡萄球菌基因操作，將為葡萄球菌生理學(xué)特性和致病性相關(guān)功能基因的研究提供重要工具。

[1] Makarova KS, Wolf YI, Koonin EV. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria [J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(8): 4360-4377.

[2] Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea [J]. Nature, 2012, 482(7385): 331-338.

[3] Gill SR, Fouts DE, Archer GL, Mongodin EF, Deboy RT, Ravel J, Paulsen IT, Kolonay JF, Brinkac L, Beanan M, Dodson RJ, Daugherty SC, Madupu R, Angiuoli SV, Durkin AS, Haft DH, Vamathevan J, Khouri H, Utterback T, Lee C, Dimitrov G, Jiang L, Qin H, Weidman J, Tran K, Kang K, Hance IR, Nelson KE, Fraser CM. Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain [J]. J Bacteriol, 2005, 187(7): 2426-2438.

[4] Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems [J]. Nat Rev Microbiol, 2015, 13(11): 722-736.

[5] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats [J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8: 172. doi: 10.1186/1471-2105-8-172.

[6] Lillest?l RK, Shah SA, Brügger K, Redder P, Phan H, Christiansen J, Garrett RA. CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties [J]. Mol Microbiol, 2009, 72(1): 259-272.

[7] Godde JS, Bickerton A. The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes [J]. J Mol Evol, 2006, 62(6): 718-729.

[8] Yosef I, Goren MG, Qimron U. Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli [J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(12): 5569-5576.

[9] Makarova KS, Aravind L, Wolf YI, Koonin EV. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems [J]. Biol Direct, 2011, 6: 38. doi: 10.1186/1745-6150-6-38.

[10] Jiang W, Maniv I, Arain F, Wang Y, Levin BR, Marraffini LA. Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity: bacteria and beneficial plasmids [J]. PLoS Genet, 2013, 9(9): e1003844.

[11] Charpentier E, Richter H, van der Oost J, White MF. Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity [J]. FEMS Microbiol Rev, 2015, 39(3): 428- 441.

[12] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III [J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[13] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(39): E2579-E2586.

[14] Plagens A, Richter H, Charpentier E，Randau L. DNA and RNA interference mechanisms by CRISPR-Cas surveillance complexes [J]. FEMS Microbiol Rev, 2015, 39(3): 442-463.

[15] Westra ER, van Erp PB, Künne T, Wong SP, Staals RH, Seegers CL, Bollen S, Jore MM, Semenova E, Severinov K, de Vos WM, Dame RT, de Vries R, Brouns SJ, van der Oost J. CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3 [J]. Mol Cell, 2012, 46(5): 595-605.

[16] Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA [J]. Science, 2008, 322(5909): 1843-1845.

[17] Hale CR, Zhao P, Olson S, Duff MO, Graveley BR, Wells L, Terns RM, Terns MP. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex [J]. Cell, 2009, 139(5): 945-956.

[18] Zhang Y, Heidrich N, Ampattu BJ, Gunderson CW, Seifert HS, Schoen C, Vogel J, Sontheimer EJ. Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis [J]. Mol Cell, 2013, 50(4): 488-503.

[19] Deveau H, Barrangou R, Garneau JE, Labonté J, Fremaux C, Boyaval P, Romero DA, Horvath P, Moineau S. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus [J]. J Bacteriol, 2008, 190(4): 1390-1400.

[20] Otto M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity [J]. Annu Rev Med, 2013, 64: 175-188.

[21] Daniel A, Bonnen PE, Fischetti VA. First complete genome sequence of two Staphylococcus epidermidis bacteriophages [J]. J Bacteriol, 2007, 189(5): 2086-2100.

[22] Yang S, Liu J, Shao F, Wang P, Duan G, Yang H. Analysis of the features of 45 identified CRISPR loci in 32 Staphylococcus aureus [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 464(3): 894-900.

[23] Weigel LM, Clewell DB, Gill SR, Clark NC, McDougal LK, Flannagan SE, Kolonay JF, Shetty J, Killgore GE, Tenover FC. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus [J]. Science, 2003, 302(5650): 1569-1571.

[24] Diep BA, Gill SR, Chang RF, Phan TH, Chen JH, Davidson MG, Lin F, Lin J, Carleton HA, Mongodin EF, Sensabaugh GF, Perdreau-Remington F. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus [J]. Lancet, 2006, 367(9512): 731-739.

[25] Climo MW, Sharma VK, Archer GL. Identification and characterization of the origin of conjugative transfer (oriT) and a gene (nes) encoding a single-stranded endonuclease on the staphylococcal plasmid pGO1 [J]. J Bacteriol, 1996, 178(16): 4975-4983.

[26] Hatoum-Aslan A, Samai P, Maniv I, Jiang W, Marraffini LA. A ruler protein in a complex for antiviral defense determines the length of small interfering CRISPR RNAs [J]. J Biol Chem, 2013, 288(39): 27888-27897.

[27] Tamulaitis G, Kazlauskiene M, Manakova E, Venclovas，Nwokeoji AO, Dickman MJ, Horvath P，Siksnys V. Programmable RNA shredding by the type III-A CRISPR-Cas system of Streptococcus thermophilus [J]. Mol Cell, 2014, 56(4): 506-517.

[28] Samai P, Pyenson N, Jiang W, Goldberg GW, Hatoum-Aslan A, Marraffini LA. Co-transcriptional DNA and RNA cleavage during type III CRISPR-Cas immunity [J]. Cell, 2015, 161(5): 1164-1174.

[29] Cao L, Gao CH, Zhu J, Zhao L, Wu Q, Li M, Sun B. Identification and functional study of type III-A CRISPR-Cas systems in clinical isolates of Staphylococcus aureus [J]. Int J Med Microbiol, 2016, 306(8): 686-696. doi: 10.1016/j.ijmm.2016.08.005.

[30] Datsenko KA, Pougach K, Tikhonov A, Wanner BL, Severinov K, Semenova E. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system [J]. Nat Commun, 2012, 3: 945. doi: 10.1038/ncomms1937.

[31] Hatoum-Aslan A, Maniv I, Samai P, Marraffini LA. Genetic characterization of antiplasmid immunity through a type III-A CRISPR-Cas system [J]. J Bacteriol, 2014, 196(2): 310-317.

[32] Carte J, Wang R, Li H, Terns RM, Terns MP. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes [J]. Genes Dev, 2008, 22(24): 3489-3496.

[33] Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJ, Snijders AP, Dickman MJ, Makarova KS, Koonin EV, van der Oost J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes [J]. Science, 2008, 321(5891): 960-964.

[34] Haurwitz RE, Sternberg SH, Doudna JA. Csy4 relies on an unusual catalytic dyad to position and cleave CRISPR RNA [J]. EMBO J, 2012, 31(12): 2824-2832.

[35] Gesner EM, Schellenberg MJ, Garside EL, George MM, Macmillan AM. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway [J]. Nat Struct Mol Biol, 2011, 18(6): 688-692.

[36] Wiedenheft B, van Duijn E, Bultema JB, Waghmare SP, Zhou K, Barendregt A, Westphal W, Heck AJ, Boekema EJ, Dickman MJ, Doudna JA. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(25): 10092-10097.

[37] Marraffini LA, Sontheimer EJ. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity [J]. Nature, 2010, 463(7280): 568-571.

[38] Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system [J]. EMBO J, 2011, 30(7): 1335-1342.

[39] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

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. QU Di，E-mail：dqu@shmu.edu.cn

CRISPR/Cas systems ofStaphylococcus

YE Lina, CHEN Li, QU Di

DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology，KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirologyofMinistriesofEducationandHealth，SchoolofBasicMedicalSciences，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200032，China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein (CRISPR/Cas) is an acquired immune system developed in evolution of prokaryotes. It provides an immune protection to resist invasion of foreign DNAs or RNAs, such as phages, plasmids and the other mobile genetic elements. CRISPR loci have been identified in genomes ofStaphylococcusspecies. The spacers of the CRISPR arrays usually match with the genes on phages or plasmids derived from the other species or strains ofStaphylococcus, and may provide a function to interfere the transmission of exogenous elements related with bacterial virulence, drug resistance and biofilm formation. This review focuses on the unique structure and function of staphylococcal CRISPR/Cas systems.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein;Staphylococcus; Exogenous nucleic acid; Bacteriophage

國家自然科學(xué)基金 (81271791)

瞿滌

2016-08-25)