李淑妃，陳曉,2，陳瑜,2(.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 30003；2.浙江大學(xué)傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 30003)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

腸道內(nèi)、外感染氣單胞菌的菌種分布特征及毒力基因分析

李淑妃1，陳曉1,2，陳瑜1,2(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310003；2.浙江大學(xué)傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003)

目的 了解腸道內(nèi)、外分離氣單胞菌菌種分布及毒力基因譜的差異，探究該菌致病性與感染部位的關(guān)系。方法 收集2013年5月至2015年9月急性腹瀉患者及腸道外標(biāo)本來源的氣單胞菌156株，采用PCR方法檢測其18種毒力基因hlyA、aerA、act、alt、ast、aexT、ascV、aopP、ascF-G、gcat、tapA、fla、Ser、exu、ahyB、eprCAI、lip、laf，并統(tǒng)計(jì)分析腸道內(nèi)、外來源氣單胞菌毒力基因譜的差異。結(jié)果 156株氣單胞菌中腸道內(nèi)氣單胞菌79株，以豚鼠氣單胞菌為主(51.9%)；腸道外氣單胞菌77株，主要為嗜水氣單胞菌(48.1%)和豚鼠氣單胞菌(39.0%)。gcat、act、fla、ahyB、exu、lip基因在腸道內(nèi)、外氣單胞菌中的檢出率較高(>45.57%)，而aexT、aopP、ascF-G、ascV則較低(<20.78%)；gcat、ahyB、laf、ast、exu、lip、hlyA、aerA在腸道內(nèi)氣單胞菌中的檢出率顯著低于腸道外(P<0.05)；嗜水氣單胞菌gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(nèi)(P<0.05)；豚鼠氣單胞菌lip、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(nèi)(P<0.05)，而aopP反之；維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內(nèi)、外的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 腸道內(nèi)、外氣單胞菌感染的菌種分布及攜帶的毒力基因譜存在差異，臨床需區(qū)別對(duì)待。

氣單胞菌；毒力基因；腸道內(nèi)；腸道外

氣單胞菌(Aeromonas)作為一種人畜共患病原菌，其感染類型在臨床上可分為腸道內(nèi)和腸道外感染，前者主要表現(xiàn)為腹瀉等胃腸炎癥狀，后者主要發(fā)生于肝硬化及惡性腫瘤等免疫功能低下患者，以血流感染和皮膚及軟組織感染為主，預(yù)后差，病死率高[1]。氣單胞菌致病涉及由不同基因編碼的多種毒力因子，包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)(aopP、aexT、ascF-G和ascV等基因)、外毒素(act、ast、alt、hlyA和aerA等基因)和與侵襲力相關(guān)的黏附因子(tapA基因)、胞外酶(gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、Ser等基因)、鞭毛(fla和laf基因)等[1]。然而，目前國內(nèi)有關(guān)腸道內(nèi)、外來源氣單胞菌的菌種分布及毒力特征的研究少有報(bào)道。為更好地了解該菌的致病能力，現(xiàn)就臨床分離腸道內(nèi)、外來源氣單胞菌的菌種分布及毒力基因譜特征進(jìn)行分析，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年5月至2015年9月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診及急診急性腹瀉(急性腹瀉：每日排便≥3次，且大便性狀有改變：呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等，持續(xù)時(shí)間≤14 d[2-3])患者糞便來源的氣單胞菌；收集同期住院患者血液、膽汁、尿液和痰液等(剔除同一患者重復(fù)菌株)來源的氣單胞菌，共156株。采用Vitek 2 Compact微生物鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，對(duì)于儀器不能區(qū)分的嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌輔以VP生化試驗(yàn)鑒定(陰性判讀為嗜水氣單胞菌)。

1.2 主要試劑及儀器 各種微生物培養(yǎng)基(杭州天和公司)；Vitek 2 Compact微生物鑒定儀及配套鑒定板條(法國生物梅里埃公司)；DNA Engine PCR擴(kuò)增儀、Mini-Protean 3水平電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；引物由上海生工公司合成；Taq DNA聚合酶、100 bp DNA marker(TaKaRa公司)。

1.3 毒力基因測定 用熱裂解法提取菌株基因組DNA。用PCR方法檢測菌株18種毒力基因，參照文獻(xiàn)[4-9]合成引物，見表1，引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括10×PCR buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O 34.7 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度(見表1)30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4 測序驗(yàn)證 各毒力基因隨機(jī)選取1株P(guān)CR陽性產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心/局部序列比對(duì)基本檢索工具(National Center for Biotechnology Information/Basic Local Alignment Search Tool，NCBI/BLAST)比對(duì)確認(rèn)。

表1 氣單胞菌毒力基因PCR檢測相關(guān)引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正的χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌種分布 共檢出氣單胞菌156株，包括豚鼠氣單胞菌71株、嗜水氣單胞菌57株、維氏氣單胞菌28株。其中腸道氣單胞菌79株，以豚鼠氣單胞菌(41株，51.9%)為主，其次為嗜水氣單胞菌(20株，25.3%)和維氏氣單胞菌(18株，22.8%)；腸道外氣單胞菌77株，包括嗜水氣單胞菌(37株，48.1%)、豚鼠氣單胞菌(30株，39.0%)和維氏氣單胞菌(10株，13.0%)。

2.2 腸道內(nèi)、外氣單胞菌的毒力基因檢出結(jié)果 經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證，除tapA僅在腸道外氣單胞菌中檢出，其他基因在腸道內(nèi)、外氣單胞菌中均有不同程度的檢出率，見表2。gcat、act、fla、ahyB、exu、lip在腸道內(nèi)、腸道外氣單胞菌中的檢出率較高(>45.57%)；aexT、aopP、ascF-G、ascV在腸道內(nèi)、腸道外氣單胞菌中檢出率較低(<20.78%)。gcat、ahyB、laf、ast、exu、lip、hlyA、aerA在腸道內(nèi)氣單胞菌中的檢出率顯著低于腸道外氣單胞菌(P<0.05)。

2.3 腸道內(nèi)、外不同氣單胞菌菌種的毒力基因檢出結(jié)果tapA基因僅在腸道外分離的3種氣單胞菌中檢出，見表3。嗜水氣單胞菌gcat、ahyB、exu、lip、eprCAI、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(nèi)(P<0.05)，而ascV在腸道內(nèi)嗜水氣單胞菌中未檢出；豚鼠氣單胞菌lip、hlyA在腸道外的檢出率顯著高于腸道內(nèi)(P<0.05)，而aopP反之；維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內(nèi)、外的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ahyB未在腸道外檢測到。

表2 腸道內(nèi)、外氣單胞菌的毒力基因檢出結(jié)果比較

表3 嗜水、豚鼠、維氏氣單胞菌毒力基因在腸道內(nèi)、外的檢出率比較

注：*表示采用Fisher精確檢驗(yàn)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)腸道氣單胞菌屬感染以豚鼠氣單胞菌為主，然而在巴西、中國香港和巴基斯坦腹瀉患者中則分別以嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和脆弱氣單胞菌及中間氣單胞菌最為常見[10-12]；而腸道外氣單胞菌感染以嗜水氣單胞菌為主，與北京地區(qū)氣單胞菌屬的流行狀況相近[13]。這些差異的存在可能是與地域環(huán)境尤其是水源的差異和病原鑒定方法的不同有關(guān)。

毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)(96.79%)的氣單胞菌至少攜帶一種毒力基因。Santos等[6]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)溶血毒素的氣單胞菌具有致病潛能。本研究發(fā)現(xiàn)>90%的腸道內(nèi)及腸道外氣單胞菌均具有溶血活性，而毒力基因檢測結(jié)果顯示與溶細(xì)胞作用相關(guān)的act、hlyA、aerA、gcat、lip基因在腸道內(nèi)、外氣單胞菌中均有不同程度的檢出。act是一種細(xì)胞毒性腸毒素基因，介導(dǎo)溶血性及細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡[1]。Wong等[7]研究表明hlyA和aerA可通過在細(xì)胞表面形成跨膜孔的方式介導(dǎo)溶血活性。攜帶gcat的氣單胞菌具有脂肪酶或磷脂酶活性，可與lip通過消化質(zhì)膜的方式溶解紅細(xì)胞[14]。

gcat、ahyB、exu、lip、hlyA、tapA在腸道內(nèi)、外的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體表現(xiàn)為嗜水氣單胞菌的gcat、ahyB、exu、lip、hlyA基因和豚鼠氣單胞菌的lip和hlyA基因在腸道內(nèi)、外的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而tapA均只在腸道外嗜水、豚鼠和維氏氣單胞菌中檢出，提示氣單胞菌部分毒力基因的分布與其來源部位、菌種類型相關(guān)。鞭毛是氣單胞菌的重要毒力因子。本研究中fla和laf2個(gè)鞭毛相關(guān)基因在腸道內(nèi)、外氣單胞菌中均有檢出，而laf在腸道氣單胞菌的檢出率明顯較低，其原因可能與兩者致病機(jī)制的不同有關(guān)。fla編碼的極性鞭毛主要介導(dǎo)細(xì)菌生物膜的形成和定植，而laf編碼的側(cè)鞭毛則介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附，引起嚴(yán)重的痢疾樣感染[1]。痢疾樣腹瀉可伴有出血，氣單胞菌則可通過破損的腸道黏膜進(jìn)入機(jī)體引起腸道外感染。Ⅲ型分泌系統(tǒng)作為近年來細(xì)菌致病機(jī)制的研究熱點(diǎn)，其相關(guān)基因ascF-G、aopP、ascV、aexT在本研究中的檢出率卻并不高，與Aravena-Román等的研究結(jié)果相一致[15]。而Burr和Frey在40株殺鮭氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)aopP、ascV、aexT的檢出率高達(dá)80%～93%[9]，Aravena-Román等也發(fā)現(xiàn)ascV、aexT在環(huán)境來源氣單胞菌中檢出率高于臨床來源氣單胞菌，從而提出T3SS毒力基因分布具有菌種及來源的相關(guān)性[15]，與本研究的結(jié)果相一致。此外，ahyB、exu、eprCAI和Ser等胞外酶基因和腸毒素基因ast和alt在腸道內(nèi)、外氣單胞菌中的普遍檢出表明氣單胞菌的致病機(jī)理十分復(fù)雜，需要更深入的研究。

鑒于氣單胞菌的毒力基因分布與其菌種和來源有關(guān)，故臨床上在治療氣單胞菌引起的感染時(shí)，要根據(jù)其感染部位和菌種類型加以區(qū)別對(duì)待。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Distribution characteristics and virulence gene analysis of intestinal and extraintestinalAeromonas

LIShu-fei1,CHENXiao1,2,CHENYu1,2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,Zhejiang; 2.StateKeyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousdiseases,ZhejiangUniversity,Hangzhou310003,Zhejiang,China)

Objective To investigate the species distribution and the difference of virulence gene spectra ofAeromonasisolated from intestinal tract and extraintestinal body fluid, and the correlation of their pathogenicity with infection sites. Methods A total of 156Aeromonasstrains isolated from the fecal specimens of patients with acute diarrhea and extraintestinal specimens were collected during May 2013 and September 2015. Eighteen virulence genes in these strains, includinghlyA,aerA,act,alt,ast,aexT,ascV,aopP,ascF-G,gcat,tapA,fla,Ser,exu,ahyB,eprCAI,lipandlaf, were detected by polymerase chain reaction(PCR). Last, the differences of virulence gene spectra between intestinal and extraintestinalAeromonaswere analyzed. Results Among 156Aeromonasstrains, 79 were from fecal specimens, and 77 from extraintestinal specimens.Aeromonascaviae(A.caviae, 51.9%) was the most common species in the intestinal strains, whileAeromonashydrophila(A.hydrophila, 48.1%) andA.caviae(39.0%) were the main pathogens in extraintestinal infections. The most prevalent virulence genes in intestinal and extraintestinalAeromonasweregcat,act,fla,ahyB,exuandlip(>45.57%), whileaexT,aopP,ascF-GandascVwere less frequently detected(<20.78%). The detection rates ofgcat,ahyB,laf,ast,exu,lip,hlyAandaerAgenes in intestinalAeromonaswere significantly lower than those in extraintestinal isolates(P<0.05). The detection rates ofgcat,ahyB,exu,lip,eprCAIandhlyAgenes in extraintestinalA.hydrophilawere significantly higher than those in intestinalA.hydrophila(P<0.05). The detection rates oflipandhlyAgenes in extraintestinalA.caviaewere significantly higher than those in intestinalA.caviae(P<0.05), while that ofaopPgene was just the reverse. There was no significant difference in the detection rates of virulence genes between intestinal and extraintestinalAeromonasveronii. Conclusion There are significant differences in the species distribution and virulence genes ofAeromonasisolated from intestinal and extraintestinal specimens, indicating that clinicians should treat them differentially.

Aeromonas; virulence gene; intestinal; extraintestinal

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.06

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004-210)。

李淑妃，1992年生，女，碩士研究生，從事腸道微生物研究。

陳瑜，主任技師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenyyu@sina.com。

R446.5

A

2017-03-27)