張 慧,姜錦林,張宇峰,單正軍,卜元卿,田 豐

(1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所/ 國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京工業(yè)大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210009)

4-壬基酚對斑馬魚(Daniorerio)胚胎/仔魚的毒性效應

張 慧1,2,姜錦林1 ①,張宇峰2②,單正軍1,卜元卿1,田 豐1

(1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所/ 國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京工業(yè)大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210009)

4-壬基酚(4-NP)作為一種穩(wěn)定的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，會對生物體的生長發(fā)育造成影響。以斑馬魚(Daniorerio)胚胎為供試體，研究4-壬基酚對斑馬魚胚胎生長發(fā)育的毒性效應。斑馬魚胚胎被暴露在一系列濃度的4-壬基酚溶液中(2.0、5.0、10.0、25.0、50.0和125.0 μg·L-1)，暴露120 h后空白組初孵仔魚因饑餓出現(xiàn)死亡即停止實驗。記錄暴露120 h內(nèi)斑馬魚胚胎的死亡數(shù)、孵化數(shù)，畸形數(shù)、仔魚體長及30 s心跳數(shù)。結果表明，4-壬基酚對斑馬魚胚胎48、72和96 h的半致死濃度(LC50)分別為131.4、47.2和26.8 μg·L-1；125.0 μg·L-1的4-壬基酚對斑馬魚胚胎的高致死效應使其孵化率顯著降低；與空白對照組相比，4-壬基酚的暴露可顯著提高斑馬魚胚胎尾部畸形率和仔魚的心包囊腫率，其中斑馬魚胚胎尾部畸形率隨處理濃度的增加而增加，呈正劑量-效應關系；經(jīng)4-壬基酚暴露處理的斑馬魚仔魚的體長及30 s心跳數(shù)較空白對照組均顯著下降。2.0 μg·L-14-壬基酚對斑馬魚胚胎及仔魚即具有致畸和致死效應，對其胚胎的發(fā)育有不利影響。

4-壬基酚；斑馬魚；胚胎發(fā)育；毒性效應

壬基酚(nonylphenol,NP)是一種重要的化工原料和中間體,屬于酚類抗氧化劑,它被廣泛應用于非離子表面活性劑、農(nóng)藥乳化劑和改性酚醛樹脂等生產(chǎn)中。在美國,壬基酚年消費量達到154 200 t,歐洲年使用量為73 500 t,我國壬基酚的年使用量為1 600 t[1]。據(jù)報道,我國水庫和河流表層水體中已檢測到壬基酚,且質(zhì)量濃度已達30.05～288.75 μg·L-1[2]。壬基酚化學性質(zhì)穩(wěn)定,不易降解,具有類雌激素作用,對生物有累積作用和致突變性[3],壬基酚現(xiàn)已被聯(lián)合國環(huán)境保護署列為需優(yōu)先控制的持久性污染物之一[4]。4-壬基酚是工業(yè)NP主要的異構體組成成分,4-NP是包括p353-NP、p363-NP、p33-NP等至少20種異構體的混合物[5-6]。在已有的的研究報道中,4-壬基酚暴露對水生生物、陸生生物及人類健康均有不同程度的影響[7-9]。

魚類胚胎在發(fā)育初期對污染物毒性反應十分靈敏,因而魚類胚胎毒性測試被廣泛應用于環(huán)境毒理學研究中[10]。其中,斑馬魚(Daniorerio)作為模式生物,被廣泛運用于早期胚胎發(fā)育的基因表達控制、化學混合物的急慢性毒性檢測和重金屬的生物累積效應研究[11-13]中。目前,4-壬基酚對生物毒性的研究還鮮有報道。筆者研究了4-壬基酚對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性,以了解其對魚類的生態(tài)毒理效應,為評價該類環(huán)境激素產(chǎn)生的環(huán)境風險提供基礎實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

試劑:4-壬基酚,(CAS:25154-52-3,純度w≥98%),乙醇(CAS:64-17-5,南京化學試劑有限公司,分析純)。

儀器:體視顯微鏡(Leica S8APO)、人工氣候培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠RXZ-280D)、微量移液槍(Eppendorf)、6孔細胞培養(yǎng)板等。

1.2 供試生物的準備

供試AB品系斑馬魚購自南京大學模式生物研究中心,并在環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所斑馬魚實驗系統(tǒng)中心馴養(yǎng)2周以上,馴化溫度為(25±2) ℃。實驗前1 d,挑選腹部膨脹且能看到生殖孔突出的8尾雌斑馬魚和外觀正常、個體均勻、反應靈敏健康的8尾雄斑馬魚,按雌雄魚數(shù)量1∶1的比例分別放入4個繁殖盒中,保持繁殖盒中水溫為(26±1) ℃,將繁殖盒放置在黑暗處,早晨用微弱的光線促進其產(chǎn)卵。2～4 h后,收集魚卵,在顯微鏡下挑選正常發(fā)育的受精卵用去離子水沖洗3次,用于暴露實驗。

1.3 溶液的配制與濃度設置

以乙醇為助溶劑配制4-壬基酚母液:ρ=500 mg·L-1,φ=22%。將4-壬基酚母液配制成不同質(zhì)量濃度的測試液:2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg·L-1。根據(jù)最低處理濃度組校準加入實驗體系的其他處理組溶液,使不同處理組外來溶液體積相同,同時,空白對照組加入相同體積的水。實驗中φ(乙醇)≤0.005 5%。乙醇染毒斑馬魚胚胎試驗表明,φ=0.005 5%的乙醇對胚胎發(fā)育無影響。因此,空白對照組采用相同體積的曝氣48 h以上的自來水。

1.4 暴露處理

暴露實驗所采用的研究方法依照GB/T 21807—2008[14],設置4-壬基酚處理組和空白對照組,每個濃度設3組平行,每組平行30枚受精卵。以6孔細胞培養(yǎng)板作為培養(yǎng)容器,每孔中加入10 mL測試液和5枚受精卵。將6孔細胞培養(yǎng)板置于光照培養(yǎng)箱中,控制溫度為(26.0±0.5) ℃,光照時間為t(日)∶t(夜)=14 h∶10 h。每隔24 h需更換1次測試液,實驗所用水為曝氣48 h以上的自來水。實驗過程中應及時挑出死亡胚胎及仔魚,避免對其他胚胎造成影響。

每天通過體視顯微鏡觀察其生長狀況,記錄并統(tǒng)計相關數(shù)據(jù):(1)記錄24、48、72、96和120 h死亡數(shù),計算死亡率:死亡率=死亡數(shù)/30×100%;(2)統(tǒng)計72 h孵化數(shù):孵化率=孵化數(shù)/30×100%;(3)24 h尾部畸形率:尾部畸形率=尾部畸形數(shù)/24 h各平行存活數(shù)×100%;(4)96 h仔魚的心包囊腫率:心包囊腫率=患心包囊腫的幼魚數(shù)/96 h各平行存活數(shù)×100%;(5)96 h仔魚的30 s心跳數(shù)及體長。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件probit模塊計算LC50。對于效應值的顯著性分析,在滿足正態(tài)分布(Shapiro-Wilk test)和方差齊性(Levene′s test)的前提下,采用方差分析(ANOVA)和多重比較(S-N-K test)分析處理之間的差異顯著性,否則，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)來檢驗處理之間的差異顯著性,P<0.05表示具有顯著差異,P<0.01表示具有極顯著差異,用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 4-壬基酚對斑馬魚胚胎/仔魚的致死效應

隨著暴露時間的增加,4-壬基酚處理組斑馬魚胚胎死亡率不斷增加,呈現(xiàn)劑量-時間效應(圖1)。

*表示P<0.05,**表示P<0.01。

高濃度組(125.0 μg·L-1)4-壬基酚溶液中斑馬魚胚胎死亡率從暴露48 h開始即出現(xiàn)顯著升高(P<0.01),暴露120 h時死亡率達95.6%。暴露120 h時,2.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1組胚胎及仔魚死亡率較空白對照組均顯著增加(P<0.01)。4-壬基酚對斑馬魚胚胎48、72和96 h的LC50分別為131.4、47.2和26.8 μg·L-1。

2.2 4-壬基酚對斑馬魚胚胎孵化的影響

暴露72 h時不同濃度4-壬基酚溶液對斑馬魚胚胎孵化率的影響見圖2。125.0 μg·L-1組斑馬魚胚胎孵化率僅為45.56%,與對照組相比顯著降低,其他濃度組斑馬魚胚胎孵化率與空白對照組間無顯著差異。

2.3 斑馬魚胚胎及初孵仔魚形態(tài)觀察

暴露在4-壬基酚溶液中的斑馬魚胚胎及剛孵出的仔魚出現(xiàn)多種毒性效應(圖3)。

**表示P<0.01。

A1、A2、A3、A4—正常生長發(fā)育的斑馬魚胚胎及仔魚;B1—暴露至24 h卵凝結胚胎;C1—尾部畸形胚胎; B2、C2—暴露至48 h發(fā)育阻滯的胚胎;B3、B4、C3—脊柱彎曲;C4—心包囊腫。

暴露24 h時,各濃度4-壬基酚處理組斑馬魚胚胎都出現(xiàn)明顯的中毒癥狀,呈現(xiàn)卵凝結(B1)和胚胎尾部畸形(C1)。暴露48 h時,出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象(B2和C2)。暴露72 h時,新孵仔魚在不同程度上出現(xiàn)體長縮短、畸形情況(B3、C3)。暴露96 h時,4-壬基酚處理組斑馬魚仔魚出現(xiàn)脊柱彎曲(B4)和心包囊腫(C4)等現(xiàn)象。

2.4 4-壬基酚對斑馬魚胚胎/仔魚的致畸效應

2.4.1 4-壬基酚對斑馬魚胚胎尾部畸形的影響

暴露24 h時,通過顯微鏡能觀察到斑馬魚胚胎尾部畸形現(xiàn)象,且斑馬魚胚胎尾部畸形率隨著4-壬基酚濃度的增加而增加,呈正劑量-效應關系(圖4)。空白組與2.0 μg·L-1處理組間無明顯差異,而與5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg·L-1處理組間差異極顯著(P<0.01)。

**表示P<0.01。

2.4.2 4-壬基酚對斑馬魚仔魚心包囊腫的影響

暴露96 h時4-壬基酚處理組斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫情況(圖5)。暴露在4-壬基酚溶液中的斑馬魚患心包囊腫率顯著高于空白對照組,其中，125.0 μg·L-1處理組斑馬魚心包囊腫率達79.44%。

**表示P<0.01。

2.5 4-壬基酚對斑馬魚仔魚體長和30 s心跳數(shù)的影響

暴露96 h時,隨機選取對照組和4-壬基酚處理組5尾幼魚,分別測量其體長(圖6)及30 s心跳數(shù)(圖7)。對照組斑馬魚仔魚體長(3.84±0.03) mm,30 s平均心跳數(shù)為67.87次,經(jīng)4-壬基酚暴露處理的斑馬魚仔魚體長及30 s心跳數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)。

**表示P<0.01。

**表示P<0.01。

3 討論

壬基酚作為一種內(nèi)分泌干擾物,具有生物富集性,能穩(wěn)定存在于水體中,對魚類、單細胞藻類、大型溞等具有不同程度的毒性[15]。生物胚胎時期特別是卵生脊椎動物如魚類,其胚胎對污染物的敏感性相對于成年個體來說更高[16]。筆者研究發(fā)現(xiàn),4-壬基酚暴露下斑馬魚胚胎死亡率較高,其48、72和96 h的LC50分別為131.4、47.2和26.8 μg·L-1,隨著4-壬基酚暴露時間的延長，LC50值降低。前人研究表明,玫瑰無須鲃(Puntiusconchonius)胚胎[17]和金魚(Carassiusauratus)胚胎[18]對壬基酚也有較高的敏感性,壬基酚對其致死效應顯著。壬基酚對斑馬魚胚胎的較高致死效應影響了胚胎孵化率。正常斑馬魚胚胎從受精后48 h開始孵化,72 h后進入早期幼魚階段。125.0 μg·L-1處理組對斑馬魚胚胎的高致死作用使其孵化率顯著降低,其72 h孵化率僅為45.56%。YANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)50 μg·L-1處理組斑馬魚胚胎卵膜變薄,使得胚胎更易受到外界污染物的毒害作用,引起胚胎死亡，進而降低胚胎孵化率。另外,也有研究表明,壬基酚會通過抑制孵化酶活性而延遲斑馬魚胚胎的孵化時間,從而影響胚胎的正常孵化[20-21]。

壬基酚對斑馬魚胚胎的形態(tài)學影響主要表現(xiàn)為卵凝結、尾部畸形和心包囊腫等現(xiàn)象,對出孵仔魚的影響主要表現(xiàn)為其體長縮短。隨著4-壬基酚暴露濃度的增加,斑馬魚胚胎卵凝結現(xiàn)象越來越嚴重,斑馬魚胚胎尾部畸形及心包囊腫等畸形現(xiàn)象逐漸顯現(xiàn),且胚胎尾部畸形率隨4-壬基酚濃度的增加呈正劑量-效應關系。4-壬基酚處理組初孵仔魚活力較弱,且2.0 μg·L-1處理組初孵仔魚體長顯著縮短。肖勤等[17]將玫瑰無須鲃受精卵暴露在不同濃度的壬基酚中,同樣觀察到胚胎卵凝結、尾部彎曲和脊椎畸形等現(xiàn)象。KINCH等[22]研究發(fā)現(xiàn),濃度為6.8 nmol·L-1的壬基酚不僅能顯著縮短斑馬魚胚胎的體長,還能縮短斑馬魚胚胎的尾長及頭部寬度。因此,壬基酚對魚類胚胎發(fā)育的毒性效應不容忽視。

4 結論

4-壬基酚對斑馬魚胚胎48、72和96 h的LC50分別為131.4、47.2和26.8 μg·L-1。125.0 μg·L-1的4-壬基酚對斑馬魚胚胎的高致死效應使得其孵化率顯著降低。另外,4-壬基酚暴露可顯著增加斑馬魚胚胎畸形率,且隨著4-壬基酚暴露濃度的增加,斑馬魚胚胎畸形率增高,呈正劑量-效應關系,畸形現(xiàn)象主要表現(xiàn)在胚胎/仔魚尾部畸形、心包囊腫和脊柱畸形等方面。與對照組相比,4-壬基酚處理組斑馬魚仔魚體長顯著縮短,30 s心跳數(shù)顯著降低。2 μg·L-14-壬基酚即對斑馬魚胚胎具有顯著的毒性效應。

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(責任編輯： 陳 昕)

Toxic Effects of 4-Nonyl Phenol on Zebrafish (Daniorerio) Embryo/Larva.

ZHANGHui1, 2,JIANGJin-lin1,ZHANGYu-feng2,SHANZheng-jun1,BUYuan-qing1,TIANFeng1

(1.Key Laboratory of Pesticide Environmental Assessment and Pollution Control, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China;2.College of Environment, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China)

4-Nonylphenol (4-NP), a stable environmental endocrine disruptor, exerts negative effects on the growth and development of organisms.Daniorerioembryos were exposed to a series of concentrations of 4-NP at 2.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 and 125.0 μg·L-1for 120 h. During the exposure, the mortality, hatching rates and abnormalities of embryos, as well as the body length and heart rates in 30 s were recorded everyday till the larva in the control group began to die as a result of hunger. The results show that the LC50ofDaniorerioembryos exposed to 4-NP after 48, 72 and 96 h were 131.4, 47.2 and 26.8 μg·L-1, respectively. The hatching rate ofDaniorerioembryos significantly declined due to the lethal effect of 125.0 μg·L-1of 4-NP. In addition, exposure to 4-NP significantly increased the tail malformation and pericardial cyst rates ofDaniorerioembryos. A positive dose-response relationship was observed in the tail malformation rates. Compared to the control group, theDanioreriolarva in all 4-NP treatment groups had shorter body length and less 30 s heart rates. These results suggested that exposure to 2.0 μg·L-1concentration of 4-NP can exert teratogenic and lethal effects on theDaniorerioembryos.

4-nonylphenol;Daniorerio; embryonic development; toxic effect

2016-08-18

環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(201309026)

X592

A

1673-4831(2017)08-0737-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.08.009

張慧(1990—),女,江蘇淮安人,碩士生,研究方向為環(huán)境生態(tài)學。E-mail: 836742441@qq.com

① 通信作者E-mail: jjl@nies.org

② 共同通信作者E-mail: zhangyuf99@126.com