顱腦爆震傷后腦組織SOD-1、NOS1和IRE1α表達變化研究

劉 穎， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 史秀云， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

·爆震傷·

顱腦爆震傷后腦組織SOD-1、NOS1和IRE1α表達變化研究

劉 穎， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 史秀云， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 分析顱腦爆震傷(bTBI)后，不同時間點小鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD-1)、一氧化氮合酶(NOS1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇酶1α(IRE1α)的表達變化，探討相關因子與時間的關系。方法 健康昆明小鼠63只隨機分為模型組和正常對照組。按照傷后時間將模型組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、7 d組和14 d組。采用Evans blue染色、Western-blot和Real-time PCR方法，觀察大腦損傷及測定傷后各組小鼠腦組織中SOD-1、NOS1和IRE1α的含量及mRNA的表達變化。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組小鼠腦組織Evans blue染色呈明顯藍色。與對照組相比，模型組小鼠腦組織各個時間點氧化應激指標SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表達均顯著增高，48 h后表達量有所降低，但仍高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 SOD-1、NOS1和IRE1α等指標參與腦爆震傷的發(fā)生和發(fā)展，監(jiān)測相關指標變化對闡明bTBI致腦損傷的發(fā)生機制具有一定的意義。

顱腦爆震傷； 超氧化物歧化酶； 一氧化氮合酶； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇酶1α

顱腦爆震傷(blast-related traumatic brain injury，bTBI)作為爆震傷發(fā)生時主要損傷[1-3]，其損傷機制復雜，臨床治療十分困難。盡管目前國內(nèi)外對bTBI進行了一定程度的研究，但有關爆震傷中顱腦損傷的致傷特點及致傷機制并未十分清楚[4-5]。因此，本研究通過建立bTBI小鼠實驗動物模型，檢測不同時間點小鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD-1)、一氧化氮合酶(NOS1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇酶1α(IRE1α)的變化，探討氧化應激在bTBI中的作用，旨在為戰(zhàn)時bTBI傷員的救治方法的研究提供理論參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2%Evans blue購自Sigma公司；鼠抗GAPDH單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗SOD-1多克隆抗體、兔抗NOS1多克隆抗體、兔抗IRE1α多克隆抗體及相應二抗均購自美國CST公司；Western-blot一抗稀釋液購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；SOD-1、NOS1、IRE1α和GAPDH引物由沈陽匯佰生物科技有限公司合成。

1.2 實驗動物及分組 選取健康雄性昆明小鼠63只，平均體質(zhì)量(20±3)g，隨機分為模型組和正常對照組。按照傷后時間將模型組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、7 d組和14 d組。清潔級動物房飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 動物模型建立 模型組采用爆震沖擊裝置建立顱腦損傷小鼠動物模型[6]。小鼠麻醉后放置于爆震傷裝置上，通過保護管保護小鼠胸腹部，頭部外露。對照組不致傷，僅作為腦組織中SOD-1、NOS1和IRE1α測定的對照。

1.4 Evans blue觀察小鼠腦損傷 各組動物處死前0.5 h經(jīng)尾靜脈注入2% Evans blue(2 ml/kg)，以1%戊巴比妥鈉30～40 mg/kg麻醉后打開胸腔，切斷右心房，于肺循環(huán)心內(nèi)灌注肝素生理鹽水(0.9%氯化鈉+20 U/ml肝素鈉)100 ml沖洗。取腦組織稱質(zhì)量，剪碎置于1 ml二甲基甲酰胺中，勻漿后60℃孵育24 h。12 000 r/min離心20 min。用酶標儀檢測波長為630 nm的吸光度，進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)繪制的Evans blue標準曲線計算Evans blue含量。1.5 Western-blot檢測腦組織SOD-1、NOS1和IRE1α含量 分別于bTBI后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、7 d和14 d提取蛋白后，將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于含3%牛血清白蛋白的TBST(含0.05% Tween-20的TBS)中室溫封閉1 h，分別用兔抗SOD-1、NOS1和IRE1α多克隆抗體及鼠抗GAPDH單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，分別用相應二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL Western印跡試劑盒進行化學發(fā)光檢測。

1.6 RT-PCR檢測SOD-1、NOS1和IRE1αmRNA表達 利用Trizol reagent提取組織總RNA。取4.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA產(chǎn)物,依次加入10×PCR緩沖液、上游與下游引物各50 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 22.0 mmol/L、TaqDNApoly-merase 1 U，以下列條件進行擴增：94℃下3 min,50℃下45 s，72℃下45 s。進行30次循環(huán)后進一步延伸，72℃下5 min。根據(jù)GenBank中SOD-1、NOS1和IRE1α cDNA序列，用引物設計軟件Primer5設計特異性引物，見表1。

表1 特異性引物

2 結(jié)果

2.1 Evans blue檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組小鼠腦組織Evans blue染色呈藍色(圖1)，Evans blue相對含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果提示，爆震傷可導致小鼠腦損傷發(fā)生。

2.2 Western-blot檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組小鼠腦組織各個時間點氧化應激指標SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表達均顯著增高，48 h后表達量有所降低，但仍高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 Evans blue檢測結(jié)果(a.模型組小鼠腦組織Evans blue染色；b.Evans blue相對含量，與對照組比較①P<0.05)

圖2 不同時間點腦組織中SOD-1、NOS1和IRE1α表達水平(與對照組比較，①P<0.05)

2.3 Real-time PCR檢測結(jié)果 各時間點腦組織SOD-1、NOS1和IRE1α的mRNA表達均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，SOD-1表達在3 h時開始升高，12 h時達到最高；NOS1、IRE1α表達在3 h時開始升高，24 h時達到最高。見表2。

3 討論

bTBI發(fā)生后，原發(fā)性損傷及繼發(fā)二次損傷可導致細胞中產(chǎn)生大量的氧自由基，進而造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸過氧化，損傷神經(jīng)細胞損傷及破壞血腦屏障完整性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，bTBI發(fā)生后小鼠腦組織Evans blue染色呈明顯藍色，Evans blue相對含量顯著升高，說明爆震傷發(fā)生對腦組織血腦屏障起到一定程度的破壞作用。

表2 不同時間點腦組織中SOD-1、NOS1和IRE1α的mRNA表達水平

注：與對照組比較，①P<0.05

SOD作為重要的過氧化物酶，在腦自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化過程中有著關鍵性的作用[8]。對于正常小鼠腦組織，氧自由基的生成與SOD的清除能力能夠形成穩(wěn)定的動態(tài)平衡；bTBI發(fā)生后，SOD消耗會明顯增多，導致生成與消耗的動態(tài)平衡破壞，進而加劇腦組織細胞損傷的發(fā)生[9]。

一氧化氮(NO)作為血管神經(jīng)活性物質(zhì)，具有參與學習記憶的形成，參與繼發(fā)性損傷，改變神經(jīng)元毒性和突觸可塑性等多種作用[10]。目前研究認為，NO在產(chǎn)生的最初幾小時具有擴張血管和抑制血小板聚集的功能，對腦損傷能夠起到一定的保護作用；但過多的NO產(chǎn)生和釋放，可通過自由基的產(chǎn)生造成神經(jīng)毒性，加劇損傷的發(fā)生[11]。NOS因能夠作用于L-精氨酸產(chǎn)生NO，進而參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種生理功能調(diào)節(jié)，已在腦損傷相關疾病中得到廣泛關注[12-13]。在腦缺血疾病發(fā)生的早期，NOS-1表達陽性神經(jīng)元數(shù)量會顯著增加，此外，在腦出血疾病發(fā)生時，NOS-1的表達同樣明顯增高。NOS活性在腦損傷疾病中上調(diào)會產(chǎn)生大量NO，進而加重腦組織損傷[14-15]。

研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腦損傷的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用[16]。IRE1α作為蛋白質(zhì)合成和加工最大的場所內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的感受蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生后，一方面會通過其絲/蘇氨酸蛋白激酶和位點特異的核酸內(nèi)切酶活性，增加蛋白質(zhì)的折疊能力，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能恢復；另一方面會通過相關通路蛋白導致細胞凋亡損傷的發(fā)生[17-18]。

本研究結(jié)果提示，bTBI發(fā)生后小鼠腦組織各個時間點化應激指標SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表達均顯著增高。bTBI后機體瞬間產(chǎn)生嚴重應激反應，SOD-1、NOS1和IRE1α等氧化應激相關因子參與bTBI的發(fā)生發(fā)展，且表達量與損傷時間具有相關性。

綜上所述，SOD-1、NOS1和IRE1α在bTBI的損傷機制探討中具有重要意義，檢測SOD-1、NOS1和IRE1α的表達變化能夠為爆震導致腦損傷的有效救治提供指導。

[1] Mathews ZR,Koyfman A.Blast injuries[J].J Emerg Med,2015,49(4):573-587.

[2] DePalma RG,Hoffman SW.Combat blast related traumatic brain injury(TBI):decade of recognition;promise of progress[J].Behav Brain Res,2016.

[3] Mazzeo AT,Beat A,Singh A,et al.The role of mitochondrial transition pore,and its modulation,in traumatic brain injury and delayed neurodegeneration after TBI[J].Exp Neurol,2009,218(2):363-370.

[4] Hellewell S,Semple BD,Morganti-Kossmann MC.Therapies negating neuroinflammation after brain trauma[J].Brain Res,2016,1640(Pt A):36-56.

[5] Marti M,Parron M,Baudraxler F,et al.Blast injuries from Madrid terrorist bombing attacks on March 11,2004[J].Emerg Radiol,2006,13(3):113-122.

[6] 柳云恩.爆震沖擊波對大鼠腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-10表達影響[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學,2016,6(4):336-340.

[7] 夏 磊,姜正林,王國華,等.人參總皂苷對腦外傷大鼠腦組織氧化應激指標的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,21(19):2219-2222.

[8] 隋 璐,劉 坤,沈 薇,等.黃芪甲苷對甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織中NO、SOD和MDA的影響[J].中國當代醫(yī)藥,2014(26):16-18.

[9] Wang Z,Cai W,Cui F,et al.Identification of a novel missense(C7W)mutation of SOD1 in a large familial amyotrophic lateral sclerosis pedigree[J].Neurobiol Aging,2014,35(3):725

[10] Huang SS,Wei FC,Hung LM.Ischemic preconditioningattenuates postischemic leukocyte-endothelial cell interactions:role of nitric oxide and protein kinase C[J].Circ J,2006,70(8):1070-1075.

[11] Kumar A,Singh A.Possible nitric oxide modulation in protective effect of against sleep deprivation-induced behavioral alterations and oxidative damage in mice[J].Phytomedicine,2008,15(8):577-586.

[12] Nishimura M,Izumiya Y,Higuchi A,et al.Adiponectinprevents cerEvans blueral ischemic injury through endothelial nitricoxide synthase dependent mechanisms[J].Circulation,2008,117(2):216-223.

[13] 韓 靚,陳 建,何志賢,等.創(chuàng)傷性腦損傷后人腦組織中誘導性一氧化氮合酶蛋白水平的研究[J].交通醫(yī)學雜志,2007,21(5):498-500.

[14] 王 梅,胡曉彤,戚大石,等.腦缺血/再灌注通過神經(jīng)性一氧化氮合酶誘導KA受體亞基GluR6巰基亞硝基化的研究[J].中國當代醫(yī)藥,2016,23(27):149-152.

[15] Nishimura M,Izumiya Y,Higuchi A,et al.Adiponectin prevents cerEvans blueral ischemic injury through endothelianitric oxide synthase dependent mechanisms[J].Circulation,2008,117(2):84-91.

[16] Tang CH,Ranatunga S,Kriss CL,et al.Inhibition of ER stress-associated IRE-1/XBP-1 pathway reduces leukemic cell survival[J].J Clin Invest,2014,124(6):2585-2598.

[17] Asakura T,Ogura K,Goshima Y.IRE-1/XBP-1 pathway of the unfolded protein response is required for properly localizing neuronal UNC-6/Netrin for axon guidance in Celegans[J].Genes Cells,2015,20(3):153-159.

[18] Oikawa D,Tokuda M,Iwawaki T.Site-specific cleavage ofCD59 mRNA by eneoplasmic reticulum-localized ribonuclease,IRE1[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360:122-127.

The changes of expressionof SOD-1,NOS1 and IRE1α in blast-related traumatic brain injury

LIU Ying,LIU Yun-en,ZHANG Yu-biao,TONG Chang-ci,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the changes of expression of SOD-1,NOS1 and IRE1α in mouse brain at different time points of blast-related traumatic brain injury(bTBI),and investigate the relationship between correlation factors and time.Methods A total of 63 healthy male rats were randomlydivided into the model group and the normal control group.According to the injury time,the rats in the model group were divided into the groups of 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours,7 days and 14 days.Evans blue,Western-blot and Real-time PCR methods were used for determination injury and expression changes of SOD-1,NOS1 and IRE1α inbrain tissue.Results Compared with normal control group,the Evans blue staining of brain tissue in model group was in significantly blue.The expression of SOD-1,NOS1 and IRE1α at different time points in brain tissue of model group were significantly increased and reduced after 48 hours,while still higher compared to the normal control group(P<0.05).Conclusion SOD-1,NOS1 and IRE1α involves in the occurrence and development of brain blast injury,which has certain significance to monitor the changes of related indicators clarifying the mechanism of bTBI induced brain injury.

Blast-related traumatic brain injury; SOD-1; NOS1; IRE1α

全軍十二五面上項目(CSY12J002)；全軍重大新藥創(chuàng)制項目(2013ZX09J13109-02B)；全軍十二五面上項目(CSY13J002)； 總后衛(wèi)生部重大新上(ASM14L008)；遼寧省自然科學基金(201602771)

劉 穎(1990-)，女，遼寧鐵嶺人，技師，碩士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0210-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.04

2017-05-12