針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影響

張玉紅,馬玲，白荷

(1.鞏義瑞康醫(yī)院，河南 鄭州 451200;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司，河南 鄭州 450009)

針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影響

張玉紅1,馬玲2，白荷3

(1.鞏義瑞康醫(yī)院，河南 鄭州 451200;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司，河南 鄭州 450009)

目的：研究五神針(針刺百會(huì)、四神聰穴)結(jié)合不同劑量的當(dāng)歸四逆湯加減對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性、黏附分子-1(ICAM-1)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)表達(dá)的影響。方法：將108只SD大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M，每組再分為3個(gè)亞組，每亞組6只。除假手術(shù)組外均建立腦缺血再灌注模型，尼莫地平片組采用尼莫地平片干預(yù)，針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝亢歪標(biāo)幐邉┝拷M分別采用五神針結(jié)合低劑量、中劑量和高劑量當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行干預(yù)，模型組和假手術(shù)組給予等量的生理鹽水。采用運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)法評(píng)估各組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力；TTC染色法檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積;采用紫外分光光度比色法檢測(cè)MPO;采用免疫組化法檢測(cè)腦組織中ICAM-1和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果：尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較，行為異常均有明顯改善(P均<0.05)，腦梗死體積明顯減少(P均<0.05)，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)有顯著的改善(P均<0.05)，針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：五神針結(jié)合高劑量當(dāng)歸四逆湯加減能夠明顯縮小腦缺血再灌注后的腦梗死體積，減輕運(yùn)動(dòng)功能缺損，有效改善MPO活性、ICAM-1和IL-lβ蛋白的表達(dá)，對(duì)缺血后的腦組織具有保護(hù)作用。

五神針；當(dāng)歸四逆湯加減；腦缺血再灌注；髓過氧化物酶；黏附分子-1；白細(xì)胞介素-1β

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury)是腦的血流中斷，造成缺血區(qū)域缺血缺氧甚至是壞死的病理改變，當(dāng)再灌注時(shí)不但不能恢復(fù)腦神經(jīng)功能反而會(huì)加重腦的損傷，即所謂的腦缺血再灌注損傷[1]。目前西醫(yī)采用抗腦缺血再灌注損傷藥物進(jìn)行治療[2]，療效雖好，但副作用較大；中醫(yī)藥對(duì)腦缺血再灌注方面的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠多途徑、多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)的作用于腦損傷部位，安全有效[3-4]。筆者多年來一直致力于針刺結(jié)合中藥湯劑治療腦缺血的臨床研究，取得了較好的療效[5-6]。為探索其在治療腦缺血再灌注疾病的內(nèi)在機(jī)理，筆者研究五神針(針刺百會(huì)、四神聰穴)結(jié)合不同劑量當(dāng)歸四逆湯加減對(duì)大鼠腦缺血再灌注后MPO活性、ICAM-1及IL-1β表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量(240±18)g，由河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(豫)2010002。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹械蛣┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M，每組18只；每組再分為3個(gè)亞組，每亞組6只。

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

JD-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠)；XJ80-2型醫(yī)用離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠)；1141002型號(hào)凝膠拍照儀(美國Wealtec公司)；免疫組化用試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；尼龍線栓(線頭直徑(0.32±0.02)mm，北京沙東生物技術(shù)公司)；QR-3268型石蠟切片機(jī)(美國AO型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī))；華佗牌針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格為0.18 mm×25 mm，批號(hào)GB2024-1994)；尼莫地平片(山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司，批號(hào)H37022797)；3%戊巴比妥(湖北武漢，批號(hào)302-17-0)；所有中藥飲片均來自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。

1.3 模型制備

造模前各組大鼠連續(xù)灌胃15 d，禁食1 d。模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M、針?biāo)幐邉┝拷M的大鼠給予3%戊巴比妥(38 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后仰臥固定，常規(guī)備皮消毒，頸中切口，從肌群間向深部分離暴露其頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)，分別近心端掛線結(jié)扎，微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉近心端距頸總動(dòng)脈分叉處5 mm處，眼科剪45°在CCA遠(yuǎn)端上剪一小口，將制備好的線栓沿切口插入，將預(yù)先置于頸內(nèi)動(dòng)脈上的掛線適度系住防止出血，后移去微動(dòng)脈夾，用眼科鑷緩慢推進(jìn)線栓，使線栓頭端通過CCA分叉進(jìn)入ICA時(shí)將栓線弧度調(diào)整為右下方，遇阻力停止，即達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，完全阻斷其血流，插入深度自CCA分叉處16～18 mm，將先前的掛線扎緊固定栓線，然后縫合肌肉皮膚，栓線尾端外露部分標(biāo)記，缺血達(dá)到2 h后小心外拉栓線約1 cm使其球端回至CCA內(nèi)，即形成再灌注，在缺血期間及再灌注后保持正常體溫，間隔抽吸氣道分泌物使呼吸道保持通暢。假手術(shù)組大鼠經(jīng)同樣麻醉后只分離血管，結(jié)扎。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 尼莫地平片組

劑量為0.126 g/kg，使用前加蒸餾水按1 g/L配制成混懸液,每日3次。

1.4.2 針?biāo)幗M

在造模后24 h，同時(shí)給予五神針結(jié)合當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行治療。針刺穴位定位方法依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]，百會(huì)，四神聰(百會(huì)穴前、后、左、右各開2 mm，共4個(gè)穴位)。百會(huì)針刺手法：采用平補(bǔ)平瀉手法，捻轉(zhuǎn)持續(xù)1 min，留針20 min。四神聰針刺手法：采用平刺手法，得氣后用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，留針20 min。每日1次，6天為1個(gè)療程，療程間休息1日，連續(xù)治療4個(gè)療程。在針刺同時(shí)給予當(dāng)歸四逆湯加減進(jìn)行治療。組方:當(dāng)歸20 g，熟地黃15 g，川芎10 g，桂枝10 g，牛膝10 g，赤芍10 g，細(xì)辛3 g，大棗 6枚，炙甘草6 g。水煎煮，給藥劑量為低劑量組10.96 g/kg，中劑量組21.92 g/kg，32.88 g/kg，早中晚各1次。

1.4.3 模型組和假手術(shù)組

給予等量的生理鹽水。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)[8]

分別于造模后1 d、3 d、5 d進(jìn)行網(wǎng)評(píng)試驗(yàn),檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)功能。大鼠可持續(xù)抓住網(wǎng)屏5 s，未滑落，計(jì)0分；大鼠可持續(xù)抓住網(wǎng)屏，有滑落但5 s內(nèi)未掉下，計(jì)1分；大鼠抓住網(wǎng)屏5 s內(nèi)掉下，計(jì)2分；網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動(dòng)過程中大鼠掉下，計(jì)3分。

1.5.2 腦梗死范圍的測(cè)定

運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)后，采用TTC染色法進(jìn)行腦梗死范圍測(cè)定?？焖贁囝^取腦，去除小腦及低位腦干，余下部分置于-20℃冰箱內(nèi)冷凍15 min，從前額極向后行冠狀位切片后，浸入2%TTC磷酸鹽緩沖液中，水浴箱中染色30 min。將染色后的腦組織放入多聚甲醛中固定24 h，數(shù)碼相機(jī)拍照后，計(jì)算腦梗死體積。腦組織非缺血部分呈現(xiàn)紅色，缺血部分呈現(xiàn)白色。應(yīng)用image J2X圖片分析軟件計(jì)算各切片組織的腦梗死面積，然后根據(jù)公式計(jì)算出腦梗死的體積，計(jì)算公式為：v=(A1+…+An)t/2，t表示切片厚度，A表示梗死面積，最后算出腦梗死灶體積百分比。

1.5.3 腦組織MPO活性的測(cè)定

將腦組織從-70℃冰箱內(nèi)取出、解凍、稱重，以試劑盒所提供的試劑配制成勻漿介質(zhì)；按重量體積比為1∶19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿；其余操作按試劑盒步驟進(jìn)行；取出后在紫色分光光度計(jì)460 nm處，測(cè)定吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算各腦組織的MPO值：MPO(單位/克濕片)=(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/11.3×取樣量(g)。其中11.3為斜率的倒數(shù)，取樣量為所含組織濕片的量。

1.5.4 免疫組化法檢測(cè)腦組織ICAM-1和IL-lβ蛋白表達(dá)水平

從4%多聚甲醛中取出腦組織，蒸餾水浸泡2 h，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟等同HE染色。石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，100%酒精Ⅰ10 min，100%酒精Ⅱ10 min，95%酒精Ⅰ5 min，95%酒精Ⅱ5 min，80%酒精5 min，蒸餾水沖洗3 min×3次。3% H2O2孵育5～10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。 蒸餾水水洗3 min×3次?？乖迯?fù)：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0)，微波爐中加熱至沸騰5～10 min后，冷卻至室溫。再重復(fù)進(jìn)行一次。 PBS緩沖液(pH值7.2)沖洗2 min×3次。擦干周圍的PBS液，不洗，滴加5%BSA(正常山羊血清)，室溫封閉20 min，滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠IL-1β，然后放入4℃冰箱內(nèi)過夜。從冰箱內(nèi)取出，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。 擦干周圍的PBS液后，滴加山羊抗兔二抗IgG，置于室溫(37℃)20 min。PBS緩沖液沖洗2 min×3次。加試劑SABC:滴加稀釋的鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合素(SABC)，室溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗5 min×4次。加DAB顯色劑：使用DAB顯色試劑盒。在1 ml蒸餾水中加試劑盒中的A、B各1滴，搖勻后加至切片,室溫中顯色。蒸餾水沖洗顯色的片子5 min，浸于蘇木精中復(fù)染。蒸餾水沖洗復(fù)染后的片子后，將載玻片放入70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，每個(gè)試劑放2 min。浸泡在二甲苯中，搬通風(fēng)柜中。光學(xué)顯微鏡下，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。光鏡下，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不同的視野，計(jì)算平均陽性細(xì)胞率。

平均陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分情況比較

假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)功能異常；模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐呓M大鼠第1 d均出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能缺損的表現(xiàn)；尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組比較，行為異常均有明顯的改善(P<0.01)，與針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較，行為異常均有明顯的改善(P<0.05)，針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較

注：與假手術(shù)組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

2.2 腦梗死體積情況比較

假手術(shù)組未出現(xiàn)明顯體積的腦梗死；模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M大鼠第1 d均出現(xiàn)大面積的腦梗死的表現(xiàn)；尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較，腦梗死體積均有明顯的減少(P<0.01)，針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組腦梗死體積比較

注：與假手術(shù)組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

2.3 MPO活性、ICAM-1和IL-lβ的蛋白表達(dá)情況比較

假手術(shù)組MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白的表達(dá)未出現(xiàn)明顯的變化；模型組、尼莫地平片組、針?biāo)幍蛣┝拷M、針?biāo)幹袆┝拷M和針?biāo)幐邉┝拷M大鼠第1 d均出現(xiàn)MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)的明顯異常；尼莫地平片組和針?biāo)幐邉┝拷M第3 d、5 d與模型組、針?biāo)幍蛣┝拷M和針?biāo)幹袆┝拷M比較，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達(dá)均有明顯的改善(P<0.01)，針?biāo)幐邉┝拷M與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3，免疫組化圖見圖1、圖2。

表3 各組MPO、ICAM-1和IL-lβ比較

注：與假手術(shù)組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注5 d IL-1β蛋白表達(dá)比較(免疫組化，×40)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注5 d ICAM-1蛋白表達(dá)比較(免疫組化，×40)

3 討論

腦血管病歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，包括缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)、火、痰、瘀阻于腦絡(luò)而出現(xiàn)半身不遂、口眼歪斜、半身麻木等臨床癥狀[10]。心、腦、腎、肝缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛、心梗都可歸屬于血行不暢形成的病癥[11-12]。各種原因?qū)е碌哪骋黄鞴偃毖?、缺氧，血流障礙及血流異常而出現(xiàn)的水腫、炎性改變、組織變性等一系列病理改變，都可以概括為血瘀證，應(yīng)用活血化瘀藥物可活其血脈、化其瘀滯[13]。治療機(jī)制主要體現(xiàn)在減輕細(xì)胞內(nèi)鈣的超載、抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放及清除氧自由基等。此外活血化瘀的藥物還具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抑菌和抗病毒的作用[14]。

西醫(yī)認(rèn)為腦缺血再灌注是一個(gè)復(fù)雜的多因素的通過多種途徑導(dǎo)致?lián)p傷的病理過程，腦缺血后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]，如興奮性氨基酸的釋放、酸中毒、過度炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)離子失衡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基的損傷和凋亡細(xì)胞基因的激活等，這些因素往往都不是單獨(dú)存在的，而是相互關(guān)聯(lián)相互重疊，共同造成腦缺血再灌注損傷[16]。

IL-1β對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與中醫(yī)中風(fēng)毒邪學(xué)說有著相似之處。毒邪的生物學(xué)基礎(chǔ)就是腦缺血再灌注后產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其中炎癥因子的過量表達(dá)就屬于其中一種[17]。炎癥因子介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)和一系列相關(guān)的氧化自由基、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒和酸中毒等反應(yīng)，是毒邪損傷腦組織的具體表現(xiàn)形式，這些毒性物質(zhì)共同作用造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，導(dǎo)致腦組織的損害[18]。ICAM-1表達(dá)是啟動(dòng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的決定因素。而黏附分子受到炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的刺激過度表達(dá)是腦缺血再灌注損傷的始動(dòng)因素。正常情況下ICAM-1處于低表達(dá)或不表達(dá)，在刺激因素、動(dòng)脈硬化、糖尿病、高血壓、缺氧及腦缺血再灌注等因素的誘導(dǎo)下，ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)[19]。在腦缺血再灌注時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞受損及炎性介質(zhì)的釋放，使各種黏附分子表達(dá)明顯增加。MPO的活性降低，可減輕對(duì)腦組織的損害，腦梗面積縮小以及神經(jīng)功能不同程度的好轉(zhuǎn)，這些都足以證明針?biāo)幗Y(jié)合針對(duì)炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的毒性效應(yīng)有很好的解毒治療作用。

針刺對(duì)腦血管疾病的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，針刺百會(huì)能夠調(diào)節(jié)氣血運(yùn)行，增加腦組織供氧量，改善人和動(dòng)物的智力功能，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)受損神經(jīng)元[20-21]。四神聰最早源至《銀海精微》，針刺四神聰可以益氣活血、補(bǔ)腦益智，改善血流變、增加腦組織供氧量，從而促進(jìn)腦部血液循環(huán)。針刺上述穴位具有活血化瘀、益智健腦的功效，可行氣活血，擴(kuò)張腦血管，增加腦組織供氧量，促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)，而神經(jīng)組織功能的恢復(fù)和腦部的血液循環(huán)密切相關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自《傷寒論》，原方由熟地黃，當(dāng)歸，桂枝，白芍，細(xì)辛，通草，大棗和炙甘草組成，具有溫經(jīng)散寒，養(yǎng)血通脈的功效。以赤芍易白芍祛瘀而不傷正，活血而不破血，藥雖平和，療效尚好;加入川芎辛溫香燥，可活血行氣，走而不守，能行散，上行可引藥人巔頂，直達(dá)上部氣血；活血應(yīng)養(yǎng)血和血，忌峻猛克伐，以熟地黃替代通草，補(bǔ)血滋潤，益精填髓。諸藥共用具有益氣活血、健腦益智的功效，能補(bǔ)益氣血，促進(jìn)腦部氣血運(yùn)行，增加腦組織供氧量，修復(fù)受損腦組織。

五神針配合高劑量當(dāng)歸補(bǔ)血湯加減可益氣活血，改善腦組織血液高凝的狀態(tài)，擴(kuò)張腦血管，促進(jìn)腦組織血液循環(huán)，促進(jìn)腦缺血再灌注， 修復(fù)腦組織神經(jīng)元， 腦髓充盛則腦竅得聰，增強(qiáng)患者的認(rèn)知和記憶能力，有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠MOP、ICAM-1和IL-1β，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，與尼莫地平具有相似的治療作用。

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河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(No.2014ZY02060)

張玉紅(1968-)，女，副主任中醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究工作。

2017-02-20

修回日期：2017-03-01

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0037-05