姜 雪，王春月，李蘭洲，王 雪，滕利榮，周毓麟

（吉林大學生命科學學院，長春 130012）

蝙蝠蛾擬青霉及蛹蟲草與野生冬蟲夏草活性比較

姜 雪，王春月，李蘭洲，王 雪，滕利榮，周毓麟*

（吉林大學生命科學學院，長春 130012）

目的 冬蟲夏草是我國珍稀藥用資源，具有多種藥理活性。但是天然蟲草產量少需求大，使其成為瀕危資源。通過研究與其具有相似的化學成分和藥理作用的蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草，可以對其進行保護。方法 利用野生冬蟲夏草、蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草的有效成分含量測定，抗疲勞活性，免疫增強活性及體外降血糖活性研究進行比較。結果 3種蟲草均含有多糖，腺苷和蟲草酸；此外，蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草中的多糖及蟲草酸含量均與冬蟲夏草相當；冬蟲夏草具有顯著的降血糖活性、抗疲勞活性和免疫增強活性；蝙蝠蛾擬青霉具有很好的降血糖活性和抗疲勞活性；蛹蟲草具有顯著的免疫增強活性和抗疲勞活性；且三者對小鼠的自主活動次數(shù)均無顯著影響，表明三者均對小鼠無刺激性。結論 蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草與野生冬蟲夏草的藥理作用相似，具有很大的發(fā)展空間。

蝙蝠蛾擬青霉；冬蟲夏草；蛹蟲草；成分含量

目前，我國蟲草的研究熱點主要有兩方面：一方面是從冬蟲夏草中分離出菌種，通過發(fā)酵生產菌絲體，以蝙蝠蛾擬青霉為代表。蝙蝠蛾擬青霉為天然冬蟲夏草中分離到的內寄生菌，是天然冬蟲夏草中普遍存在的一種蟲草的無性型，經(jīng)過深層發(fā)酵所得的菌絲體與天然冬蟲夏草的主要成分、藥理作用基本相似；另一方面是人工培養(yǎng)蛹蟲草。蛹蟲草，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，是蟲草菌寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體及幼蟲形成的蟲菌復合體，與天然冬蟲夏草相比，同樣能夠調節(jié)全身功能，促進抗體形成，提高免疫力，主要有保肺益腎養(yǎng)肝、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等功能[1-4]。本文從蟲草有效成分含量測定，抗疲勞活性，免疫增強活性及體外等方面對蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和冬蟲夏草進行研究[5-8]。通過有效含量、體外糖消耗實驗、自主活動、抗疲勞活性和免疫增強活性等方面對蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草的活性進行比較，以期對蝙蝠蛾擬青霉和蛹蟲草的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 SYNEK GY4型酶標儀（美國伯騰公司）；BP221S型電子天平（德國塞多利斯公司）；MiniSpin型高速離心機（德國Eppendorf公司）；GSY?II型恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設備廠）；旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；小型粉碎機FW-100（天津泰斯特）小鼠自主活動測試儀ZZ-6（成都泰盟）；小鼠疲勞轉棒儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；動物跑步機FT-200（成都泰盟軟件有限公司）；SPD?10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.1.2 材料 菌種：蛹蟲草子實體（購于沈陽乾翔有限公司），蝙蝠蛾擬青霉（本實驗室發(fā)酵獲得），野生冬蟲夏草（來自西藏那曲冬蟲夏草原產地）。動物：健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，購自吉林大學醫(yī)學部實驗動物中心，許可證號：SCXK（遼）2014-001。試劑：0.25 %胰蛋白酶（購于北京奧博星），二甲基亞砜（購于國藥集團化學試劑有限公司），噻唑藍（購于上海源葉生物科技有限公司）。試劑盒：Mouse IL-2 Elisa Kit（購于美國RND公司），葡萄糖試劑盒-GLU（長春匯力，YZB/國 0760-2003，批號：20060226）。

1.2 試驗方法

1.2.1 有效成分含量測定[9-10]采用小型粉碎機粉碎冬蟲夏草、蝙蝠蛾擬青霉、蛹蟲草子實體，粉末過40目篩。將蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草分別在40 ℃熱水浸提，液料比（mL:g=40:1），提取3 h，提取液8 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀重復提取1次，提取液經(jīng)過40 ℃減壓濃縮，冷凍干燥得到固體粉末的蝙蝠蛾擬青霉，蛹蟲草和野生冬蟲夏草，并采用高效液相色譜法測定3種蟲草中所含的腺苷，苯酚-硫酸法測多糖含量，比色法測提取液中蟲草酸的含量。

1.2.2 體外糖消耗實驗研究[11-12]HepG2 細胞用含10 %胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃，5 %的CO2條件下培養(yǎng)，隔天更換細胞培養(yǎng)液。待細胞增值到80 %左右，PBS 沖洗 3 遍，加0.25 %含 0.02 % EDTA的胰蛋白酶消化。選取對數(shù)生長期的細胞，將HepG2 細胞以104 個/孔 接種于 96 孔板中。本實驗設置正常對照組、蛹蟲草水提物組、野生冬蟲夏草子實體水提物組、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物，3個實驗組的劑量分為125、250、500 μg/mL 3個濃度。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，各組分別加入不同的含藥培養(yǎng)基，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)于在37 ℃，5 % CO2條件下培養(yǎng)24 h ，測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。檢測結束后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)基，加 150 μL DMSO，充分震蕩使其完全溶解，490 nm 下測定吸光度，計算細胞存活率，達到 90 % 以上即認為此濃度對細胞活力無明顯影響。

1.2.3 飼養(yǎng)動物 健康balb-c小鼠80只，雌雄各半，隨機分為4組，每組20只，分別灌胃蛹蟲草子實體水提物（CM，0.5 g/kg），野生冬蟲夏草子實體水提物（CS，0.15 g/kg）和蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物（PHC，0.2 g/kg），灌胃7 d后進行實驗研究。

1.2.4 自主活動研究 將各組灌胃后小鼠置于安靜陰涼處，靜置30 min，放入自主活動箱中，蓋上避光板，使小鼠適應2 min后，記錄小鼠5 min內的站立次數(shù)和活動次數(shù)，5 min后，將小鼠取出，打印測試結果。

1.2.5 抗疲勞活性研究[13-14]耐力跑實驗：末次給藥后30 min，將小鼠置于FT-200動物跑步機中，放置好動物后，對小鼠進行訓練，使其了解逃離帶電區(qū)域，將轉速設為20 r/min，電流調到最高，記錄小鼠5 min內被電擊的次數(shù)。疲勞轉棒實驗：末次給藥30 min后，將各組小鼠分別放在轉棒儀上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，20 r/min。各組小鼠進行實驗前，對其進行適當訓練，小鼠在轉棒上跌落3次后，開始記錄小鼠由于肌肉疲勞從轉棒上跌下的時間。負重游泳實驗：末次灌胃后30 min，將小鼠放入水中游泳，水深30 cm，水溫（25±1.0）℃，鼠尾根部負荷5 %體質量的鉛塊，記錄小鼠自游泳開始至力竭，作為小鼠的力竭游泳時間。以小鼠頭部沉水后超過8 s還無法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作為力竭判斷標準。

1.2.6 免疫增強活性研究[15-16]小鼠眼眶取血，用Mouse IL?2 Elisa Kit試劑盒檢測小鼠血漿中IL-2含量，450 nm處測定OD值，比較3種蟲草對小鼠IL-2含量的影響。

2 結果

2.1 有效成分含量檢測結果 見表1。

表1 有效成分含量檢測結果 %

結果表明：從3種有效成分的含量檢測中可以看出蛹蟲草和蝙蝠蛾擬青素的主要化學成分與野生冬蟲夏草相似。

2.2 體外糖消耗實驗研究結果 見表2。

表2 對Hep-G2細胞糖消耗率的影響 %

結果顯示，在濃度相同的情況下，蝙蝠蛾擬青素菌絲體水提物對Hep-G2細胞的糖消耗率影響最為明顯，即有顯著的降血糖活性，野生冬蟲夏草水提物次之，蛹蟲草水提物的影響最弱。

2.3 自主活動結果 蛹蟲草子實體（CM）明顯減少小鼠5 min內的站立的次數(shù)（P＜0.05），說明對小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產生了一定程度的抑制效應，其安全性有待進一步研究；野生冬蟲夏草（CS）子實體與蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物（PHC）對小鼠5 min內站立與自主活動次數(shù)均無顯著影響，說明二者對小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)無刺激性，具有良好的安全性。

2.4 抗疲勞活性研究結果 與空白組相比，蛹蟲草子實體（CM）和蝙蝠蛾擬青霉水提物（PHC）能顯著提高小鼠的游泳時間，減少小鼠所受電擊的次數(shù)并提高了疲勞轉棒時間，具有極好的抗疲勞活性。野生冬蟲夏草能減少小鼠所受電擊的次數(shù)（P＜0.05），提高小鼠的疲勞轉棒時間(P＜0.05)。上述實驗結果可以看出，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體,蛹蟲草子實體與野生冬蟲夏草均具有明顯的抗疲勞活性。

2.5 免疫增強活性研究結果 小鼠血漿中的IL-2水平有所提高（P＜0.05），證明蛹蟲草子實體和野生冬蟲夏草對小鼠有一定的免疫增強活性，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物對小鼠血漿IL-2水平無顯著性影響，初步證明蝙蝠蛾擬青霉（PHC）不能夠增強正常小鼠機體的免疫活性。

3 小結

本實驗結果顯示，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物，蛹蟲草子實體與野生冬蟲夏草均屬于蟲草類真菌，都含有多糖，腺苷和蟲草酸，且蛹蟲草和蝙蝠蛾擬青霉中多糖和蟲草酸的含量與野生冬蟲夏草相當[17]。初步證明二者可以起到與野生冬蟲夏草相當?shù)谋＝⌒ЧＴ跐舛认嗤那闆r下，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體水提物對Hep-G2細胞的糖消耗率影響最為明顯，即有顯著的降血糖活性，野生冬蟲夏草水提物次之，蛹蟲草水提物的影響最弱，故蝙蝠蛾擬青霉可以作為降血糖藥物，同時還具有一定的抗疲勞活性，無刺激性且安全性較高。蛹蟲草具有顯著的抗疲勞活性和免疫增強活性，但對小鼠有一定的刺激，安全性有待進一步研究。綜合以上結果可以得出，蝙蝠蛾擬青霉水提物和蛹蟲草子實體在醫(yī)療和保健領域具有很大的發(fā)展空間，二者的進一步開發(fā)利用將為人類的醫(yī)療事業(yè)乃至生態(tài)環(huán)境帶來一大進步。

[1] HE JL. Review on the evaluateion standard of body fatigue[J]. 2013, 34(2): 29-31.

[2]吳敬梅, 李燕平, 瞿亮, 等. 冬蟲夏草甘露醇含量的高效液相色譜法測定[J]. 食藥用菌, 2016, 24(6): 388-392.

[3]樊曉飛, 楊明, 姜磊, 等. 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體化學成分的研究[J]. 菌物研究, 2013, 11(2): 72-77.

[4]江海濤, 任源浩, 吳雨龍, 等. 蛹蟲草多糖對小鼠抗疲勞作用的研究[J]. 食用菌學報, 2014, 21(3): 55-59.

[5]許宇輝, 梁慧春, 楊征. 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體抗小鼠力竭疲勞作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2014, 28(3): 351-357.

[6]胡賢達, 黃雪, 王彪, 等. 冬蟲夏草抗腫瘤及免疫調節(jié)作用的研究進展[J]. 藥物評價研究, 2015, 38(4): 448-452.

[7]趙施施, 張科學, 包素紅, 等. 丙泊酚對幼小鼠自主活動和學習記憶行為的影響[J]. 中國藥理學通報, 2013, 29(2): 198-201.

[8]蔡溱, 陳方劍, 陸松偉, 等. 冬蟲夏草膠囊對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 解放軍藥學學報, 2014, 30(2): 118-121.

[9]孟澤彬, 陳林會, 韓近雨, 等. 蛹蟲草化學活性成分的研究進展[J]. 分子植物育種, 2015, 13(9): 2147-2154.

[10]張姝, 張永杰, BHUSHAN S, 等. 冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌的研究現(xiàn)狀、問題及展望[J]. 菌物學報, 2013, 32(4): 577-597.

[11]黃麗俊, 李利東, 袁建新, 等. 冬蟲夏草研究現(xiàn)狀及展望[J].農學學報, 2014, 4(8): 63-65.

[12]王米, 張麗芳, 楊銳樂, 等. 蛹蟲草多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖及IL-2和INF-γ分泌的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2015, 45(8): 848-853.

[13]樸美子, 王曉東. 蛹蟲草黃豆對小鼠的抗氧化及免疫作用[J].中國食品學報, 2014, 14(5): 32-37.

[14]汪宇, 楊光照, 康萬軍, 等. 高效液相色譜法測定天然冬蟲夏草和蛹蟲草及其人工培養(yǎng)物中3個核苷類化合物含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2015, 35(9): 805-808.

[15]欒潔, 陳雅琳, 儲智勇, 等. 冬蟲夏草子實體對小鼠抗疲勞及耐缺氧能力的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(1): 47-48.

[16]許宇輝, 梁慧春, 溫泉, 等. 蝙蝠蛾擬青霉菌絲體對小鼠體力疲勞及缺氧的影響[J]. 軍事醫(yī)學, 2014, 38(10): 784-790.

[17]陰婉婷, 李彤, 馬辰. 改良的苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖含量[J]. 安徽農業(yè)科學, 2015, 43(4): 117-118, 173.

Activity comparisonstudy onPaecilomyces Hepiali, Cordyceps Militaris and Wild Cordyceps Sinensis

JIANG Xue, WANG Chunyue, LI Lanzhou, WANG Xue, TENG Lirong, ZHOU Yulin*
(College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China)

Objective Cordyceps sinensis is a rare medicinal resource in our country which has a wide range of pharmacological activities. But natural Cordyceps sinensis has less yield and large market demand, which becomesan endangered resources. We can protect Cordyceps sinensis by studying Paecilomyces hepialid and chinese caterpillar fungus, which have similar chemical composition and pharmacological effects with Cordyceps sinensis. Methods Compare Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris with Wild Cordyceps Sinensis on active components, antifatigued action, immuno-enhancing activity and in vitro hypoglycemic activity. Results All of this three caterpillar funguses have polysaccharides, adenosine and cordycep, moreover, the content of cordycep and polysaccharides in Paecilomyces hepialid and Cordyceps Militaris are equivalent with those in Cordyceps Sinensis; Cordyceps sinensis has great hypoglycemic activity, immuno-enhancing activity and anti-fatigued activity; Paecilomyces hepialid has great anti-diabetes activity and some anti-fatigued activity; Cortices militaris has great immuno-enhancing and antifatigued activity; And they all have no signifcant effect on mice’s autonomic activities, which indicates that they have no irritation on mice. Conclusion The pharmacological action of Paecilomyces hepialid and Cortices militaris is similar to that of Cordyceps sinensis, which has great potential for development.

Paecilomyces hepialid; Cordyceps Sinensis; Cordyceps Militaris; component content

R285.1

A

2095-6258(2017)04-0544-04

2016-11-02）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.010

吉林省“雙十工程”重大科技成果轉化項目“冬蟲夏草菌的發(fā)酵粉關鍵技術攻關及產品開發(fā)”（20130201006ZY）。

姜 雪（1994 -），女，碩士研究生，主要從事微生物與生化藥學研究。

*通信作者：周毓麟，男，碩士，電話-13756146186，電子信箱-zhouyl@jlu.edu.cn