方芳，顧媛媛，郭玉巖，馬艷春，王艷麗，周海純，張丹丹，張洪財(cái)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江護(hù)理高等專(zhuān)科學(xué)校，黑龍江 哈爾濱 150301；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

穿山龍降糖制劑的降糖藥理作用研究

方芳1，顧媛媛1，郭玉巖1，馬艷春1，王艷麗2，周海純3，張丹丹1，張洪財(cái)1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江護(hù)理高等專(zhuān)科學(xué)校，黑龍江 哈爾濱 150301；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：本實(shí)驗(yàn)篩選穿山龍?zhí)崛∥锝笛怯行Р课?，為制備穿山龍降糖制劑做基礎(chǔ)準(zhǔn)備。方法：應(yīng)用大鼠模型，通過(guò)測(cè)定空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹血清胰島素等指標(biāo)，確定穿山龍降血糖有效部位。結(jié)果：治療前后各組大鼠體重呈逐漸下降趨勢(shì)，正常組呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；治療前后正常組大鼠空腹血糖呈水平變化，穿山龍組血糖表現(xiàn)為下降趨勢(shì)、二甲雙胍組大鼠空腹血糖呈先下降后上升趨勢(shì)，模型組大鼠空腹血糖呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)；治療8周后，模型組、穿山龍組、二甲雙胍組與正常組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療8周后，模型組、二甲雙胍組空腹血清胰島素水平與正常組比較，穿山龍組空腹血清胰島素水平與正常組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：穿山龍降血糖有效部位具有較好的治療效果，可制備成穿山龍降糖制劑。

穿山龍；降血糖；藥理作用

糖尿病是胰島素作用障礙或分泌缺陷引起血糖升高為特征的代謝性疾病，是危害人類(lèi)生命健康的重大疾病，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)居首位。目前，治療方式為服用西藥和改變生活方式。西藥主要類(lèi)型包括：二甲雙胍，二肽基肽酶IV抑制藥、a-葡萄糖苷酶抑制藥、胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物磺脲類(lèi)、PPAR-γ激動(dòng)藥、胰島素等。雖然西藥療效顯著，但耐用性低，毒副作用大，不適合長(zhǎng)期服用[1-2]。如何安全、有效防治糖尿病成為世界各國(guó)學(xué)者共同關(guān)注的焦點(diǎn)。糖尿病在中醫(yī)學(xué)屬于“消渴”范疇,《金匱要略》《千金要方》《普濟(jì)方》均有記載。中藥治療該病歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富，流傳了很多經(jīng)方。因此，研發(fā)中藥(天然藥物)降血糖成為熱點(diǎn)，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

穿山龍(DioscoreanipponicaMak.)為薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，又稱(chēng)穿地龍、穿山薯蕷、穿龍骨、穿龍薯蕷、地龍骨等。性溫，味苦、甘。功效為舒筋通絡(luò)、止咳平喘、活血止痛、祛風(fēng)除濕[3-4]。我國(guó)主要分布于東北、浙江北部、江西等地，朝鮮、俄羅斯等國(guó)也有野生資源[5]。穿山龍主要化學(xué)成分包括延齡草皂苷、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷及水溶性皂苷，另外淀粉、甾醇、樹(shù)脂、氨基酸、尿囊素、黃酮、多糖類(lèi)等成分[6-12]。穿山龍的現(xiàn)代藥理學(xué)作用主要包括：有鎮(zhèn)痛、抗炎、降尿酸、抗疲勞、抗高脂血癥、緩解更年期綜合征、降糖、平喘、耐缺氧、抗腫瘤、抗氧化、保肝作用[13-16]。本項(xiàng)目前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)穿山龍?zhí)崛∥锞哂薪笛堑乃幚碜饔?，基于此，進(jìn)一步篩選出穿山龍?zhí)崛∥锝笛怯行Р课?，為制備穿山龍降糖制劑做基礎(chǔ)準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)大鼠70只，體質(zhì)量(190±5)g，雌雄各半，由本校GLP提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黑)2013-012。

1.2 受試藥品

穿山龍藥材購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院；穿山龍總皂苷咀嚼片，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20160915；二甲雙胍，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20160619。

1.3 耗材與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)，北京酷萊博科技有限公司；糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒，上海晶都生物科技有限公司；血清胰島素測(cè)定試劑盒，武漢明德生物科技有限公司；葡萄糖液體試劑盒，上海源葉生物技術(shù)有限公司； 特異性引物，北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司；乙醇等有機(jī)試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司； Trizol M-MLV First Strand Kit，上海北諾生物科技有限公司。

1.4 儀器

AL204型電子天平，深圳市盛美儀器有限公司；UV-6100S型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；DNM-9602A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司；GL-12M離心機(jī)，蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司；武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司； IQTM5型熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型的建立

選取SPF級(jí)大鼠70只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成正常組8只和造模鼠62只，雌雄分籠飼養(yǎng)。造模鼠進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)，正常組用普通飼料喂養(yǎng)，造模鼠用高脂飼料喂養(yǎng)。兩周后，以35 mg/kg的劑量對(duì)造模大鼠一次性腹腔注射使用0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液配制的10 mg/mL的鏈脲佐菌素溶液。正常組給予同體積的枸櫞酸鹽緩沖液注射。72 h后測(cè)定空腹血糖，2型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥16.7 mmol/L，觀察大鼠血糖值及死亡情況，隔日后對(duì)未達(dá)該標(biāo)準(zhǔn)的造模大鼠以30 mg/kg劑量的鏈脲佐菌素溶液一次性腹腔補(bǔ)充注射。1周后，隨機(jī)測(cè)定血糖值≥16.7 mmol/L，為糖尿病模型建立成功。成模大鼠隨機(jī)分成模型組11只，穿山龍組12只，二甲雙胍組11只。

2.2 給藥方法

所有模型制備成功后，正常組、模型組給予等量的飲用水，穿山龍組按0.675 g/(kg·d)給藥，二甲雙胍組0.1 g/kg給藥，各組每天灌胃給藥。連續(xù)8周。

2.3 觀察指標(biāo)、檢測(cè)步驟

2.3.1 一般狀況觀察

定期觀察包括動(dòng)物的精神狀況、體質(zhì)量、尿量等。

2.3.2 空腹血糖的測(cè)定

造模72 h后，治療4周后，各組大鼠眼眶靜脈竇采血1 mL，治療8周后大鼠斷頸取血1 mL，收集血清離心后，按葡萄糖液體試劑盒測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.3.3 糖化血紅蛋白的測(cè)定

治療8周后各組大鼠斷頸取血2 mL，收集血清離心后，棄上清液，放入冰箱-20℃保存，按糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.3.4 空腹血清胰島素的測(cè)定

治療8周后各組大鼠斷頸取血1 mL，收集血清離心，放入冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫捎肊LISA法檢測(cè)。按大鼠Insulin定量試劑盒操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

釆用SPSS16.0軟件分析，組間使用t檢驗(yàn)，以P<0.05及P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較

治療4周，模型組與正常組比較，穿山龍組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，穿山龍組與二甲雙胍組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療8周，二甲雙胍組、穿山龍組與各自治療4周的自身前后對(duì)照中，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，穿山龍組與模型組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，穿山龍組與二甲雙胍組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量比較±s,g)

3.2 空腹血糖動(dòng)態(tài)變化比較

表2 各組大鼠治療前后空腹血糖比較±s,mmol/L)

治療前后正常組血糖呈水平變化，穿山龍組血糖呈下降趨勢(shì)、二甲雙胍組大鼠空腹血糖呈先下降后上升趨勢(shì)，模型組大鼠空腹血糖呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)。治療前模型組、穿山龍組、二甲雙胍組較正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組、穿山龍組、二甲雙胍組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療4周，穿山龍組與正常組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療8周，穿山龍組與治療4周的自身前后對(duì)照比較、與正常組、模型組、二甲雙胍組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

3.3 糖化血紅蛋白比較

治療8周后，模型組、穿山龍組、二甲雙胍組與正常組比較，有顯著性差異(P<0.01)。與二甲雙胍組比較，穿山龍組能降低糖化血紅蛋白，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠治療8周后糖化血紅蛋白比較±s)

3.4 空腹血清胰島素比較

治療8周后，模型組、二甲雙胍組空腹血清胰島素水平與正常組比較，穿山龍組空腹血清胰島素水平與正常組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。穿山龍組空腹血清胰島素水平與模型組比較，二甲雙胍組空腹血清胰島素水平與模型組比較，也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與二甲雙胍組比較，穿山龍組能增加空腹血清胰島素水平(P<0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠治療8周后空腹血清胰島素比較±s,ng/mL)

4 討論

糖尿病特征為并發(fā)癥多，病程較長(zhǎng)，并且機(jī)理復(fù)雜。目前無(wú)理想的治療藥物。中醫(yī)藥在治療該病過(guò)程中發(fā)揮著多功效、多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹血清胰島素指標(biāo)，確定了穿山龍降血糖有效部位。(1)對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響[17],治療8周，較模型組，穿山龍組、二甲雙胍組均能減輕糖尿病大鼠體質(zhì)量的下降。(2)對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖的影響[18]，治療8周，穿山龍組較自身治療周、較二甲雙胍組均能持續(xù)降低血糖，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從分子生物學(xué)角度，穿山龍片能維持降糖作用可能與穿山龍片較二甲雙胍中藥能持續(xù)保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、能增加受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多勒點(diǎn)作用有關(guān)。(3)對(duì)糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的影響[19-20]，穿山龍組、二甲雙胍組較模型組均能明顯降低糖化血紅蛋白，有顯著性差異，表明穿山龍片、二甲雙胍組中藥均能有效長(zhǎng)期的降低血糖；穿山龍片組較二甲雙胍組中藥能有效降低大鼠糖化血紅蛋白，表明穿山龍片長(zhǎng)期降糖作用較二甲雙胍組中藥作用更強(qiáng)，這可能與穿山龍片降糖效果顯著有關(guān)，也可能與穿山龍片中化學(xué)成分能抑制蛋白非酶糖化過(guò)程以減少糖基化產(chǎn)物形成等作用有關(guān)。(4)對(duì)糖尿病大鼠空腹血清胰島素的影響[21]，穿山龍組較模型組均能升高空腹血清胰島素水平，穿山龍組較二甲雙胍組中藥也能升高空腹血清胰島素水平，有顯著性差異。這可能與穿山龍組較二甲雙胍組中藥更能抑制免疫反應(yīng)、保護(hù)細(xì)胞、改善胰島素受體后抵抗等作用有關(guān)。

本課題組對(duì)穿山龍有效部位降糖機(jī)制進(jìn)行了初探，觀察骨骼肌GLUT4、CAP mRNA相對(duì)表達(dá)，結(jié)果顯示兩者的擴(kuò)增、溶解曲線，均有特異性擴(kuò)增。表明其降糖作用機(jī)制之一是GLUT4、CAP mRNA的表達(dá)增加。對(duì)穿山龍有效部位降糖機(jī)制、作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步深入研究。下一步將對(duì)其降糖有效部位進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究，通過(guò)柱色譜、分析型(制備型)HPLC、NMR、MS等方法系統(tǒng)化學(xué)成分研究，鑒定(表征)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，對(duì)成分進(jìn)行體內(nèi)、外降糖活性篩選確定有效成分(群)。闡明其降糖藥效物質(zhì)及提供先導(dǎo)化合物。隨著科技的進(jìn)步，應(yīng)用新技術(shù)(新方法)尋找治療效果顯著、作用緩和、毒副作用小的單體化合物。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)降糖新制劑提供理論基礎(chǔ)。

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Pharmacological Study of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae Action of Lowering Blood Sugar

FANG Fang1, GU Yuan-yuan1, GUO Yu-yan1, MA Yan-chun1, WANG Yan-li2,ZHOU Hai-chun3, ZHANG Dan-dan1, ZHANG Hong-cai1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangNursingCollege,Harbin150301,China; 3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective: This research screened the effective part for lowering blood sugar fromRhizomaDioscoreaeNipponicaeextract, laying a foundation for anti-diabetes medicinal extracted fromRhizomaDioscoreaeNipponicae. Methods: The effective part for lowering blood sugar fromRhizomaDioscoreaeNipponicaewas determined by testing fasting blood glucose(FBG), HbA1c, serum fasting insulins(FINs) in diabetes rats. Results: Before and after treatment, the body weight of each group gradually decreased, it showed a trend of growth in the normal group; the fasting blood glucose of the normal group showed no obvious change, FBG was gradually increased in the model group, it showed a decreasing trend in theRhizomaDioscoreaeNipponicaegroup, whereas it showed a decreasing trend first following an increasing trend in the Metformin group; After eight weeks of treatment, there was a significant difference in terms of FINs between the normal group and the other groups (P<0.05). Conclusion: The effective part ofRhizomaDioscoreaeNipponicaehas a good therapeutic blood-lowering effect and it can be prepared into a patterned preparation.

RhizomaDioscoreaeNipponicae; Lowering blood sugar; Pharmacological effects

2016-10-08

2016-11-04

哈爾濱市科學(xué)技術(shù)局科技創(chuàng)新人才應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)(青年后備人才)項(xiàng)目(2016RQQXJ125)；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)(LBH-Z16193)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目(201210)

方芳(1980-)，女，博士，助理研究員，從事中醫(yī)藥研究工作。

*通訊作者：張洪財(cái)(1983-)，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：中藥有效成分的活性研究及先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0033-04