徐坤范

（山東省臨清市農(nóng)業(yè)局，臨清 252600）

芝麻菜可溶性蛋白提取工藝的研究

徐坤范

（山東省臨清市農(nóng)業(yè)局，臨清 252600）

以芝麻菜為試驗(yàn)材料，對考馬斯亮藍(lán)法提取可溶性蛋白的工藝進(jìn)行了研究。采用單因素試驗(yàn)對影響可溶性蛋白的主要因素提取溶劑及其濃度、料液比和提取時間進(jìn)行初步研究，然后進(jìn)行正交試驗(yàn)，再采用方差分析驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)確定的提取工藝，并進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：NaCl溶液為最佳的提取溶劑；芝麻菜可溶性蛋白提取的最佳條件為0.15 mol/L NaCl溶液、料液比1∶20、提取時間15 min，平均提取量為15.43 mg/g；3個因素對芝麻菜可溶性蛋白提取的影響程度大小先后順序?yàn)椋篘aCl溶液濃度＞料液比＞提取時間。

芝麻菜 可溶性蛋白 考馬斯亮藍(lán)法

芝麻菜（Eruca sativa Mill），又稱火箭生菜、紫花南芥等，是十字花科芝麻菜屬，一年生草本植物，原產(chǎn)歐洲南部，我國西北、華北、華東等地均有野生種，或作油料作物栽培，因葉片含有芝麻香味，故稱芝麻菜[1]。芝麻菜含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、鐵、鈣、鋅、硒和粗蛋白質(zhì)，味道鮮美，清香可口，深受消費(fèi)者青睞[1]；經(jīng)常食用可以提高免疫力和肝臟解毒的功能，而且還可以降低血液中膽固醇含量，防止或減緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程[1]；并具有保健作用，如具有較強(qiáng)的防癌作用，能促進(jìn)細(xì)胞活性，對久咳有特效，還可治療尿頻[2]。因此芝麻菜極具開發(fā)價值，而且能填補(bǔ)淡季蔬菜品種[3]。

芝麻菜中蛋白質(zhì)含量是影響其營養(yǎng)品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)的重要因素之一。果蔬可溶性蛋白測定方法較多，有Folin—酚試劑（Lowry）法、雙縮脲法、微量凱式定氮法等，但是這些方法都存在很多的不足，如Folin—酚試劑法操作繁瑣，費(fèi)時，干擾物質(zhì)多，專一性差，誤差較大[4，5]；雙縮脲法雖較快速、蛋白質(zhì)特異性影響小，但是靈敏度差，所需樣品量大，準(zhǔn)確度較差[4]；微量凱氏定氮法雖然準(zhǔn)確度高、具有普遍性，但是操作繁瑣[4]；考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法以反應(yīng)快速、操作簡便、靈敏度高、干擾物質(zhì)較少，而且穩(wěn)定性好[6]等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)

用在蘋果[7]、獼猴桃[8]、小米[9]等多種植物組織可溶性蛋白測定和酶比活力[10]的測定。該文以芝麻菜為實(shí)驗(yàn)材料，首先對影響蛋白質(zhì)提取的因素（提取溶劑、提取溶劑的濃度、料液比和提取時間）進(jìn)行了單因素測定試驗(yàn)，然后綜合單因素試驗(yàn)進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，再采用方差分析驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)確定的提取工藝，并進(jìn)行優(yōu)化。確定可溶性蛋白提取的最佳條件，以期為其它蔬菜可溶性蛋白提取條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的制備

于2016年3月20日將白花芝麻菜播種于拱圓大棚中，待芝麻菜生長到30 d，5片真葉時達(dá)到商品成熟度，隨機(jī)取芝麻菜葉片洗凈（待水滴干）。稱取芝麻菜鮮樣1.00 g，放入研缽中加入2 ml提取溶劑研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用8 ml提取溶劑分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5～1 h以充分提取，然后放入離心機(jī)3 000r/min 離心10 min，即得待測樣品提取液，上清液備用，重復(fù)3次[7]。

1.2 方法

1.2.1 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法

參考鄧麗莉[7]等的研究方法。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管，在試管中分別精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml）0.0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，加蒸餾水至1 ml，分別配制成濃度為0、20、40、60、80、100 μg/ ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后在各支試管中分別加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，在室溫下靜置反應(yīng)5 min左右。在595 nm波長處比色測定吸光度。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6，11～13]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 不同提取溶劑對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

精確稱取芝麻菜鮮樣1.00 g，在45 ℃，料液比為1∶10，提取時間為45 min條件下，考察不同提取溶劑對測定芝麻菜可溶性蛋白含量的影響，分別加10 ml蒸餾水（pH=7）、NaOH溶液（pH=12.56）、NaCl（pH=6.71）溶液和醋酸（pH=3）溶液（0.1 mol/L），3 000r/min離心10 min，各重復(fù)3次，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定芝麻菜中可溶性蛋白含量，以確定最佳提取溶劑。

1.3.2 不同濃度的提取溶劑對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

以1.3.1確定的提取溶劑為基準(zhǔn)，控制其他因素不變，考察該提取溶劑溶液濃度對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響，精確稱取芝麻菜鮮樣，共計5份，每份1.00 g，分別加入10 ml（0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L）的該提取溶劑溶液，各重復(fù)3次，確定提取溶劑的最佳濃度，其它操作同上。

1.3.3 不同料液比對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

以1.3.1和1.3.2確定的提取溶劑及其濃度為基準(zhǔn)，分別精確稱取芝麻菜白花品種鮮樣1.00 g，控制其他因素不變，對不同料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25進(jìn)行試驗(yàn)，各重復(fù)3次，確定最佳的料液比。

1.3.4 不同提取時間對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

以上述確定的提取溶劑及其濃度和料液比為基準(zhǔn)，考察不同時間對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響，精確稱取芝麻菜鮮樣，共計5份，每份1.00 g，分別放置15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，各重復(fù)3次，確定最佳的提取時間。

1.3.5 正交試驗(yàn)

圖2 提取溶劑對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。根據(jù)確定的提取條件，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行驗(yàn)證。在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以NaCl鹽溶液濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，確定每個因素的3個水平，根據(jù)L9（34）正交表設(shè)計試驗(yàn)，并計算可溶性蛋白提取量，以可溶性蛋白含量為評價指標(biāo)優(yōu)選工藝。

圖3 不同濃度的NaCl鹽溶液對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

圖4 不同料液比條件對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

圖5 不同提取時間對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果計算

采用 Excel 2 010統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)并作圖，利用DPS9.5軟件對差異顯著性進(jìn)行分析。

樣品中蛋白質(zhì)的含量（mg/g）=C*VT（/V1*FW） *1 000[13]

C：查標(biāo)準(zhǔn)曲線值（μg）；VT：提取液總體積（ml）；FW：樣品鮮重（g）；V1：測定時加樣量（ml）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

考馬斯亮藍(lán)提取可溶性蛋白時，R在0.99～1是可接受的[21]。由圖1可知，考馬斯亮藍(lán)提取可溶性蛋白時R2（相關(guān)系數(shù)）=0.997 6，說明線性關(guān)系較好，此法提取芝麻菜可溶性蛋白質(zhì)是可行的。

2.2 不同溶劑對可溶性蛋白提取量的影響

由圖2可知，提取溶劑對測定芝麻菜中可溶性蛋白含量有著顯著的影響，隨著提取溶劑pH值的增加，可溶性蛋白提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)提取溶劑為NaCl（pH為6.71）時可溶性蛋白提取量最大，顯著大于提取溶劑的提取量；提取溶劑為NaOH（pH為12.56）時提取量最低；因此確定以NaCl溶液為提取溶劑。

2.3 可溶性蛋白提取量的單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同濃度的NaCl溶液對可溶性蛋白提取量的影響

由圖3可以看出，芝麻菜可溶性蛋白提取量隨NaCl溶液濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)鹽溶液濃度為0.15 mol/L時，可溶性蛋白的提取量最大，顯著高于其他各濃度處理，可溶性蛋白提取量為13.32 mg/g；當(dāng)NaCl溶液濃度＞0.15 mol/L時，再增加鹽溶液的濃度，提取量反而降低，這可能是由于隨著NaCl溶液濃度的增加，芝麻菜中其它的雜質(zhì)也被更多地提取出來，使提取液中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低。因此試驗(yàn)選擇0.15 mol/L作為鹽溶液濃度篩選其他因素。

2.3.2 不同料液比對測定可溶性蛋白提取量的影響

由圖4可知，可溶性蛋白提取量開始時隨著料液比的增大而增大，料液比在1∶20時提取量最大為14.52 mg/g；隨溶劑用量的增加，提取出的蛋白質(zhì)反而減小?？紤]到料液比的大小會影響后續(xù)過濾操作以及溶劑回收過程的難易，故試驗(yàn)選擇料液比為1∶15～1∶25較為合適。

2.3.3 不同提取時間對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響

由圖5可知，提取時間對芝麻菜可溶性蛋白提取量的影響與NaCl濃度和料液比對可溶性蛋白提取量的影響一致，即隨著提取時間的增加提取量先升高后降低，提取時間30 min時提取量最高，顯著高于其他各時間處理，芝麻菜可溶性蛋白提取量為13.20 mg/ g，隨后再延長提取時間，提取出的可溶性蛋白反而減小，尤其當(dāng)提取時間延長到75 min時提取量迅速降低，可溶性蛋白為11.40 mg/g，可溶性蛋白提取量迅速降低的原因可能是放置的時間過長，有些蛋白質(zhì)可能發(fā)生了變質(zhì)現(xiàn)象，且考慮到提取時間的延長會影響試驗(yàn)的操作，因此試驗(yàn)提取時間選擇為30 min左右較為合適。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析

2.4 芝麻菜可溶性蛋白提取條件的正交試驗(yàn)

根據(jù)芝麻菜可溶性蛋白提取的單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取NaCl濃度、料液比及提取時間進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。

由表1可知，芝麻菜可溶性蛋白提取的最佳組合為A2B2C3，即最佳提取條件為NaCl溶液濃度為0.15 mol/L、料液比為1∶20、提取時間為45 min；由R值可知，三個單因素對芝麻菜可溶性蛋白提取的影響程度大小先后順序?yàn)椋篈（NaCl溶液濃度）＞ B（料液比）＞C（提取時間）。

通過方差分析，因?yàn)锳（NaCl溶液濃度）和 B（料液比）的F值＞均大于 F0.05（2，2）=19.00，是顯著因子，對A（NaCl溶液濃度）和 B（料液比）的選擇應(yīng)選最好的水平A2和B2，即（NaCl溶液濃度為0.15 mol/L，料液比為1∶20，因?yàn)镃因子提取時間不是顯著因子，可以任選，從節(jié)約時間角度可選擇C1（15 min）；方差分析結(jié)果NaCl溶液濃度的F值大于料液比的F值，提取時間的F值最小，這與極差R分析結(jié)果一致。

稱取芝麻菜樣品3份，每份1.00 g，按優(yōu)選工藝條件A2B2C1進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測定結(jié)果分別為15.49 mg/g、15.22 mg/g、15.58 mg/g，平均提取量為15.43 mg/g，表明可溶性蛋白提取的工藝條件較好，說明此工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論與討論

在不同提取劑中，以NaCl鹽溶液提取，芝麻菜可溶性蛋白提取量最高；芝麻菜中可溶性蛋白提取的最佳工藝條件為0.15 mol/L NaCl溶液、料液比為1∶20、提取時間為15 min，可溶性蛋白的平均提取率為15.43 mg/g，芝麻菜中蛋白質(zhì)平均含量為2.48%[1]，因此芝麻菜可溶性蛋白的提取率為62.22%；由R值和F值可知，3個單因素對芝麻菜可溶性蛋白提取的影響程度大小先后順序?yàn)椋篘aCl溶液濃度＞料液比＞提取時間；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該提取工藝簡單、穩(wěn)定、可行，為芝麻菜進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

[1] 寇鳳仙，樊新華，齊巧麗．芝麻菜的開發(fā)利用及栽培技術(shù)．河北農(nóng)業(yè)科技，2002，（8）：14

[2] 楊銀娟，王偉群，施穎紅，等．珍稀蔬菜—芝麻菜的栽培技術(shù)及營養(yǎng)價值．上海蔬菜．2011，（3）：76～77

[3] 林蒲田．保健新蔬—芝麻菜．湖南農(nóng)業(yè)，2008，（3）：14

[4] 蔣立科，羅曼．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計與實(shí)踐．北京：高等教育出版社，2007．10

[5] 何幼鸞，湯文浩．物化學(xué)實(shí)驗(yàn)．武漢：華中師范大學(xué)出版社，2006．8

[6] BRADFORD M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding．Analytical Biochemistry，1976，72（1/2）：248～254

[7] 鄧麗莉，潘曉倩，生吉萍，等．考馬斯亮藍(lán)法測定蘋果組織微量可溶性蛋白含量的條件優(yōu)化．食品科學(xué)，2012，33（24）：185～189

[8] 李淼，檀根甲，李瑤，等．獼猴桃品種酚類物質(zhì)及可溶性蛋白含量與抗?jié)儾〉年P(guān)系．植物保護(hù)，2009，35（1）：37～41

[9] 劉劍利，曹向宇，李其久．小米蛋白提取方法比較研究．食品工業(yè)，2009，（3）：30～31

[10] BERüUTER J. Carbohydrate metabolism in two apple genotypes that differ in malate accumulation. Journal of Plant Physiology，2004，161（9）：1011～1029

[11] 呂巧枝，木泰華，孫艷麗.甘薯葉可溶性蛋白提取工藝研究.食品研究與開發(fā)，2007，28（03）：18～21

[12] A.Ghazi，S.Metwali etal.Protein isolates from Egypeian sweet potato leaves.Die Nahrung，1982，33（2）：145～151

[13] 李雪雁，張維，張秀蘭，等.菊芋可溶性蛋白的提取及其分子質(zhì)量的測定.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，136（13）：184～186

[14] 王福榮.生物工程分析與檢驗(yàn).北京：中國輕工業(yè)出版社，2005，140～148.