金武 杜榮輝 曹探賾

初治肺結核患者維生素D與其受體基因多態(tài)性位點FokI的相關性分析

金武 杜榮輝 曹探賾

目的 分析初治肺結核患者血清維生素D(VD)與維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性位點FokI的相關性。方法 對我院隨機選取的180位初治肺結核患者和100位正常對照的血清VD水平，VDR基因多態(tài)性位點FokI基因型進行檢測，比較和分析2組血清VD水平與VDR基因FokI多態(tài)性差異以及相關性。結果 初治肺結核患者血清VD水平明顯低于正常對照組(P<0.0001)；初治肺結核組VD營養(yǎng)缺乏率(70.5%)明顯高于正常對照組(47.0%)，VDR基因多態(tài)性位點FokI的三種基因型(純合子FF，純合子ff和雜合子Ff)在兩組內的分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.033)，初治肺結核組純合子ff及等位基因f比率明顯高于正常對照組(P<0.05)；初治肺結核患者基因型ff組VD水平明顯低于基因型FF組和基因型Ff組(P<0.05)。結論 初治肺結核患者血清VD水平明顯下降，VDR 基因多態(tài)性位點FokI基因型ff為肺結核易感基因。

初治肺結核；維生素D；維生素D 受體；FokI；基因多態(tài)性

肺結核是目前全世界重要的公共衛(wèi)生問題。越來越多研究顯示維生素D(VD)在肺結核防治方面有一定作用。研究表明，VD 的活化代謝產物1,25-二羥維生素D3 (1,25-(OH)2-D3)可誘導并增強巨噬細胞對結核分枝桿菌的殺菌功能。VD的缺乏與結核易感性存在相關性[1]。維生素D受體(VDR)是由染色體12q上的VDR基因編碼，該基因具有多種單核苷酸多態(tài)性，且VDR基因多態(tài)性也與活動性肺結核易感性有關[2]。但是VD與VDR基因多態(tài)性位點的關系還不明確。本實驗通過對初治肺結核患者血清VD水平和VDR基因多態(tài)性位點FokI的檢測，擬明確初治肺結核患者血清VD水平與VDR基因多態(tài)性位點FokI的相關性。

資料與方法

一、研究對象

隨機選取2015年4月至2016年10月期間在我院就診的初治肺結核患者(180例)，以及同一時期在我院體檢的正常對照(100例)作為研究對象。依據(jù)肺結核診斷和治療指南[3]診斷初治肺結核。排除標準：合并患有人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、肝臟疾病、腎功能衰竭、腎結石、惡性腫瘤、糖尿病、懷孕、甲狀旁腺功能亢進；服用任何糖皮質激素、免疫抑制劑、噻嗪類利尿劑、鈣補充劑、VD等。所有研究對象均簽署知情同意書，所有實驗均符合本院倫理委員會規(guī)定。

二、研究方法

1 血清VD的檢測：兩組均于清晨空腹留取外周靜脈血5mL，其中3mL用于制備血清，-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。另外2mL提取全基因組DNA，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。VD采用放射免疫法(radiate immuno assay, RIA)檢測，使用25-(OH)D3放射免疫試劑盒(DiaSorin, USA)對血清樣本進行檢測。所有的檢測步驟均嚴格按說明書進行。

2 VDR 基因FokI多態(tài)性檢測：采用苯酚/氯仿提取法提取全血基因組DNA。根據(jù) Genebank 中 VDR 基因的序列，由上海英駿生物技術有限公司合成含F(xiàn)okI多態(tài)位點的引物[4]，即正義鏈5’-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3’，反義鏈5’- ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’。采用PCR試劑盒(Beyotime, China)擴增VDR基因目的片段，然后用限制性內切酶FokI(New England Biolabs)對PCR擴增產物在37℃下酶切反應4小時。限制性酶切片段在2.5% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。根據(jù)酶切模式，基因型分為：純合子FF，產物大小為265bp；純合子ff，產物大小為169bp和96bp；雜合子Ff，產物大小分別為265bp，169bp和96bp。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、血清VD的檢測結果

對初治肺結核(PTB)和正常對照組(Con.)的基本特征及血清25-(OH)D3的檢測發(fā)現(xiàn)，初治肺結核患者的平均體質量指數(shù) (body mass index，BMI)，25-(OH)D3水平明顯低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。兩組在年齡和性別的差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。(見表1)。

表1 研究對象的基本特征±s)

二、VD營養(yǎng)水平差異

為更清楚地觀察VD營養(yǎng)水平在初治肺結核和正常對照組中的分布特征，我們按VD缺乏(<20 ng/mL)、不足(20-30 ng/mL)、充足(>30 ng/mL)進行分層比較[5]。PTB組VD營養(yǎng)缺乏率達70.5%，高于正常對照組的47.0%。PTB組VD水平充足的比例僅12.8%，低于正常對照組的22.0%。2組之間差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=15.202,P=0.0005)。(見表2)。

表2 初治肺結核患者血清VD營養(yǎng)水平差異(n%)

三、VDR基因FokI多態(tài)性變化

根據(jù)FokI 多態(tài)性位點的差異，VDR的基因型分為：純合子FF，酶切產物大小為265bp；純合子ff，酶切產物大小為169bp和96bp；雜合子Ff，酶切產物大小分別為265bp，169bp和96bp，(見圖1)。在肺結核組和正常對照組內均檢測到這三種基因型。其中，PTB患者VDR基因FF基因型比率(28.3%)低于正常對照組(42.0%)，ff基因型比率(13.9%)高于正常對照組(7.0%)，差異具有統(tǒng)計學意義 (χ2=6.818,P=0.033)。PTB患者VDR基因等位基因F比率(57.2%)低于正常對照組(67.5%)，等位基因f比率(42.8%)高于正常對照組(32.5%)，差異具有統(tǒng)計學意義 (χ2=5.703,P=0.017)。(見表3)。

圖1 限制性內切酶檢測VDR基因FokI 多態(tài)性位點。純合子FF 無 FokI酶切位點，酶切電泳后只有一個條帶(265bp，Line2，6和7)；純合子ff含有FokI酶切位點，酶切電泳后有兩個條帶(169bp和96bp，Line4，8和9)；雜合子Ff含有FokI酶切位點，酶切電泳后有3個條帶(265bp，169bp和96bp，Line3，5和10)。M=Marker，Line1為非酶切PCR產物(265bp)。

表3 初治肺結核患者與正常對照組VDR基因FokI多態(tài)性比較(例%)

四、VDR基因FokI多態(tài)性與VD的關系

通過分析初治肺結核患者VDR基因多態(tài)性位點FokI三種基因型與VD的關系發(fā)現(xiàn)，純合子ff組25-(OH)D3水平明顯低于純合子FF組和雜合子Ff組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。純合子FF組和雜合子Ff組25-(OH)D3水平差異無統(tǒng)計學意義。(見表4)。

表4 初治肺結核患者及正常對照組FokI多態(tài)性與VD的關系

討 論

維生素D調整人體鈣磷代謝平衡的作用已得到廣泛認同。隨著對 VD 的進一步研究發(fā)現(xiàn)，它還有免疫調節(jié)功能，減少呼吸消化系統(tǒng)的感染性疾病發(fā)病率[6]。VD 的免疫調節(jié)作用是多方面的[7]，一方面，VD可促進單核細胞向巨噬細胞轉化，當結核分枝桿菌感染人體后，巨噬細胞分泌大量多種細胞因子，進而刺激 T 淋巴細胞活化，分泌包括 IFN-γ在內的很多細胞因子，以盡快啟動抗結核免疫反應；另一方面，VD 可通過抑制抗原呈遞細胞的成熟，防止抗原呈遞細胞過度刺激 T 淋巴細胞，調節(jié) T 淋巴細胞的適度反應，抑制 TNF-α過量產生的免疫病理損傷。

維生素D有3種代謝產物：1, 25-(OH)2-D3，1,24,25-(OH)3-D3，25-(OH)D3。其中以25-(OH)D3在血液中濃度最高，最穩(wěn)定，且半衰期最長，又是合成1, 25-(OH)2-D3的前體。因此，它是反映體內維生素D的最佳指標[5,8]。VDR是維生素D生物活性形式1, 25-(OH)2-D3發(fā)生作用的主要受體。VDR基因于1988年被克隆出來，其位于人12號染色體長臂上，包括9個編碼的外顯子和8個內含子，共編碼427個氨基酸，5’端非編碼區(qū)包括1A、1B、1C外顯子，2-9號外顯子編碼基因的蛋白產物。VDR基因具有高度多態(tài)性，目前報道有22個點突變均可導致基因功能缺失，已經證實基因多態(tài)性與多種疾病相關，如多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎、乳腺癌、糖尿病、惡性黑色素瘤、銀屑病、骨質疏松等[9]。VDR基因有4個常見的單核苷酸多態(tài)性位點，分別是FokI、BsmI、ApaI和TaqI。多態(tài)性位點FokI位于VDR基因第2外顯子的起始密碼子上，是唯一能影響編碼氨基酸的多態(tài)位點，目前很多實驗證明該位點是由于427ATG→ACG突變導致，其多態(tài)性的存在使VDR基因第2外顯子上有兩個潛在的起始轉錄點，即使VDR翻譯從第2個密碼子開始，從而導致翻譯出的蛋白質比正常VDR基因編碼少了3個氨基酸(aa)，為424個aa，但424aa的轉錄活性大大增強[10-11]

本實驗在初治肺結核組和正常對照組內均檢測到VDR基因多態(tài)性位點FokI三種基因型FF，F(xiàn)f，ff。在VDR 基因多態(tài)性中，F(xiàn)F 型(42.0%)及 Ff 型(51.0%)在普通人群中所占的比例較高，而 ff基因型(7.0%)所占人群比例偏低，但相比較初治肺結核的患病人群中，攜帶ff 基因型(13.9%)的患者遠高于普通人群攜帶ff基因的比例，因此很多科研人員認為ff型基因為結核易感基因。通過分子生物學方面的研究還發(fā)現(xiàn)，VDR 基因 FokI 位點中ff基因型影響 VDR 活性，致使 VDR 與 VD 形成復合體發(fā)揮抗結核的功能受到了不利影響[12-13]。

VD 在人體內發(fā)揮作用是通過保持其適宜范圍的濃度，保證 VDR 有足夠的啟動因子來實現(xiàn)的。而 VDR 在細胞核上的表達數(shù)量、構象結構、與 VD 的結合能力、形成復合物后啟動下一步反應的能力也最終決定了其發(fā)揮相應生物學作用的能力[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)okI三種基因型在 VD 濃度方面表現(xiàn)出FF組和Ff組明顯高于ff組，F(xiàn)F組和Ff組之間差異無統(tǒng)計學差異。由此可見，VDR 基因FokI多態(tài)性與 VD 濃度以及結核的易感性有關，ff基因型患者VD合成不足，且更易患肺結核。

總之，初治肺結核組患者血清維生素D水平明顯下降，且VDR基因FokI多態(tài)性發(fā)生變化。VDR 基因多態(tài)性與血清VD水平和肺結核易感性有相關性，ff基因型人群可能需要預防低VD血癥及肺結核可能。

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Association of vitamin D with its receptor genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis

JINWu,DURong-hui,CAOTan-zhen

theThirdWardsofInternalMedicine,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan,Hubei430030,China

Objective To analyze the correlation between vitamin D (VD) and vitamin D receptor (VDR) genetic polymorphism site FokI in newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients. Methods 180 newly diagnosed pulmonary tuberculosis patients (PTB) and 100 healthy control were randomly selected. Their serum VD levels and VDR genetic polymorphism site FokI were detected and compared. Results Serum VD level was significantly lower in the PTB group than in the control group (P<0.0001). The deficiency of VD was significantly higher in the PTB group (70.5%) than in the control group (47.0%). The difference of the three genotypes (homozygous FF, homozygous ff and heterozygous Ff) of VDR polymorphism site FokI in the two groups was statistically significant (P=0.033). The rate of homozygous ff and allele f in the PTB group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of VD in the ff group was significantly lower than in the FF group and the Ff group in PTB (P<0.05). Conclusion The level of serum VD decreases significantly in newly diagnosed PTB. VDR genetic polymorphism site FokI genotype ff is the susceptibility gene of PTB.

newly diagnosed pulmonary tuberculosis; vitamin D; vitamin D receptor; FokI; genetic polymorphism

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.09.031

430030 湖北 武漢，武漢市肺科醫(yī)院內三病區(qū)

2017-01-14]