楊世東，孔 龍，廖路花，陶文鑫，姚麗強，張星楠

(東北電力大學(xué) 建筑工程學(xué)院，吉林 吉林 132012)

一株苯酚降解菌分離及降解特性研究

楊世東，孔 龍，廖路花，陶文鑫，姚麗強，張星楠

(東北電力大學(xué) 建筑工程學(xué)院，吉林 吉林 132012)

從實驗室模擬煤化廢水處理裝置的好氧段取污泥，先利用含苯酚的富集培養(yǎng)基篩選出對苯酚具有良好耐受性能的菌株(記為JX，JY，JZ)；再利用以苯酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基，從以上三種菌株中篩選出一株對苯酚具有良好降解性能的菌株(JY)。對JX，JY，JZ的培養(yǎng)特征以及生理生化特征進行觀察與鑒定。將菌株JY進行了16S rDNA基因序列的測定，最終確定該菌株為不動桿菌屬(Acinetobacter)。并研究了菌投加量、溫度、pH、以及搖床轉(zhuǎn)速對JY的生長量以及酚降解率的影響。結(jié)果表明：菌株JY的最佳菌投加量為3%，最適溫度為30 ℃～35 ℃，最佳pH為7.0，最佳搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

苯酚降解；棒桿菌屬；遺傳學(xué)與基因；降解特性

苯酚是造紙、煉焦、塑料等工業(yè)廢水中主要的污染物，其具有難降解、毒性大的特點[1-3]。處理煤化廢水中酚類物質(zhì)的方法當(dāng)中，生物法較物理法[4]、化學(xué)法來說[5]，具有高效、經(jīng)濟的優(yōu)點。所以篩選出高效降酚菌是目前國內(nèi)外研究學(xué)者研究的工作重點，以達到優(yōu)化降酚菌群的目的。目前，國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)篩選出很多苯酚降解菌，如假單胞菌(Pseudomonas sp.)，芽孢桿菌(Bacillus sp.JY01)，魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii UWT)，桿菌株菌株(GXY-1)等[6-8]。可是上述降酚菌對高濃度苯酚的耐受性均不高，且很少有學(xué)者在篩選出苯酚降解菌之后，繼續(xù)探究其對其他酚類的耐受性及降解性能。因此，本研究希望通過兩批次的篩選，篩選出對苯酚具有較高耐受性的降酚菌，同時對其它酚類的耐受性及降解性能進行研究探討，為其在實際煤化廢水處理中能達到更好的效果提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌源

實驗室模擬煤化廢水處理裝置好氧段的污泥[9]。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[10]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水1 000 mL。

含苯酚培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際所需要的苯酚量進行相應(yīng)的添加。

無機鹽培養(yǎng)基[11]：NH4CL 1 g/L，K2HPO40.6 g/L，MgSO40.6 g/L，F(xiàn)eSO43 mg/L，蒸餾水1 000 mL。

苯酚唯一碳源培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際所需要的苯酚量進行相應(yīng)的添加。

每一種培養(yǎng)基在配置好后，應(yīng)將pH調(diào)節(jié)到7.0～7.2，且若需相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，則在其原來的基礎(chǔ)上加入18 g～20 g的瓊脂粉。

1.1.3 儀器

HZQ-X300恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，WFZ-UV3802H紫外分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)，SW-CJ-21-D凈化工作臺(上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分離、純化

(1)菌種的富集

通過在實驗流程的好氧段取污泥5 g，加入一定量的去離子水，放在磁力攪拌器上攪拌10 min，靜置5 min后取其上清液。吸取5 mL上清液，置入富集培養(yǎng)基中，在30 ℃，130 r/min條件下進行連續(xù)富集培養(yǎng)24 h[12-13]。

(2)分離與純化

在無菌操作下，用接種環(huán)將無機鹽培養(yǎng)的最終菌液挑去少許，畫線于瓊脂平板上，于30攝氏度的條件下在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。為了使菌株更加純化，用平板培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)接分離2次。第1批篩選：以含高濃度苯酚培養(yǎng)基進行篩選，此輪篩選出的包括所有耐酚的細菌(能以苯酚為碳源的和不能以苯酚為碳源的菌種)，篩選出2～3種；第2批篩選：用以苯酚為單純碳源的培養(yǎng)基對第1批的2-3種細菌進行二次篩選，此輪篩選出來的就是能以苯酚為單一碳源的菌種。

被第2輪篩選掉的就是不能以苯酚為碳源但是對苯酚耐受的菌種。

1.2.2 菌株的鑒定

在實驗室條件下，通過觀察對得到的菌株進行培養(yǎng)特征的鑒定[13]，在對其進行傳統(tǒng)的生理生化性能的鑒定，完成初步鑒定[14]。其遺傳學(xué)與基因的鑒定委托于上海生物工程有限公司進行鑒定。

1.2.3 苯酚濃度的測定

采用4-氨基安替比林直接光度法[15]。

1.2.4 菌株的生長曲線

利用接種環(huán)向富集培養(yǎng)基當(dāng)中接入適量菌體，置入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min，每3小時取一定的菌液，對其吸光度OD進行測量，繪制菌株JY的生長曲線[16-17]。

1.2.5 菌株降解特性

對所得的最終菌種，在初始苯酚濃度為1 000 mg/L條件下，探究不同菌投加量、溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速對其降解性能的影響，恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，測OD值以及苯酚降解率[18-19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選和鑒定

2.1.1 菌株的篩選

通過第一批篩選得到三株菌，記為JX、JY、JZ。其中三株對苯酚的耐受性為2 000 mg/L。通過第二次篩選，確定上述三株菌中，JY菌可以以苯酚為唯一碳源。

2.1.2 菌株培養(yǎng)特征的鑒定

對三株菌進行培養(yǎng)特征的鑒定，結(jié)果見表1，圖1為顯微觀察圖。其中圖1(a)、圖1(b)、圖1(c)分別為JX、JY、JZ的顯微觀察圖。

表1 菌落形態(tài)特征和顯微觀察

圖1 菌株顯微觀察

2.1.3 菌株生理生化特征的鑒定，結(jié)果見表2。

表2 生理生化試驗結(jié)果

查閱《常見細菌鑒定手冊》初步鑒定菌株JY為不動桿菌(Acinetobacter)。

根據(jù)鑒定結(jié)果，通過委托上海生物工程有限公司對菌株JY進行16S rDNA分子鑒定，最終確定JY為Comamonas testosteroni，相似性為99%，登錄號CJ568123。

圖2 菌株生長曲線

圖3 菌投加量對苯酚降解性能的影響

圖4 溫度對降解率的影響

2.2 菌株生長曲線

繪制的生長曲線，如圖2所示。由圖2可知，在富集培養(yǎng)基當(dāng)中，苯酚降解菌JY前6個小時，處于延遲期階段，之后就開始進入到迅速生長的時期，在這個時間段內(nèi)，菌株JY的生長活性最好，所以在之后的各種降解實驗當(dāng)中，選取這個時間段內(nèi)的菌株作為研究對象。在12個小時之后，菌株的生長開始進入到穩(wěn)定增長階段。在18個小時之后，菌體開始出現(xiàn)部分的死亡。當(dāng)出現(xiàn)一部分的菌株死亡之后，營養(yǎng)物質(zhì)對于剩下的菌株來說，相對足夠，所以在21小時之后，菌體數(shù)量又出現(xiàn)一點的增長。之后又開始出現(xiàn)部分菌株的死亡，這是由于生長物質(zhì)又開始出現(xiàn)不足的現(xiàn)象。

2.3 各因素對苯酚降解性能的影響

2.3.1菌投加量對苯酚降解性能的影響

在無菌操作條件下，取對數(shù)期菌株JY，按不同的接種量接入到苯酚無機鹽培養(yǎng)基當(dāng)中，置入恒溫培養(yǎng)箱進行振蕩培養(yǎng)。初始苯酚含量為1 000 mg/L，接種量為分別為1%，3%，5%，7%，9%，11%。在30 ℃情況下，恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，測其剩余苯酚濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在接種量為1%時，菌株的潛伏期過長，不利于苯酚的降解。隨著菌投加量的逐漸增加，菌株JY對苯酚的降解率也在慢慢的提高。當(dāng)接種量達到5%時，降解率也達到了最大，計為93.08%。此時，繼續(xù)增加菌投加量時，降解率則隨之逐漸又略微的下降，這是由于投加的菌量過多，而培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)又相對不足，菌株菌體之間對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭較為激烈，進而對苯酚的降解有所影響。因此，菌株JY的最佳接種量為5%，并以此接種量進行接下來的各種特性研究。

2.3.2 溫度對苯酚降解性能的影響

在無菌操作條件下，取對數(shù)期菌株JY按接入到初始苯酚含量為1 000 mg/L的苯酚無機鹽培養(yǎng)基中，接種量為5%，在不同溫度下進行振蕩培養(yǎng)，溫度分別為15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，置入恒溫培養(yǎng)箱進行振蕩培養(yǎng)24 h后，測其剩余苯酚濃度以及OD值，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，溫度的不同，對JY菌的影響較大，通過進行24 h的降解實驗之后，該菌株對苯酚進行降解率較好的溫度范圍為30 ℃～35 ℃，降解率最高可達92.33%。與此同時，菌液的濃度也相對較高。所以，30 ℃～35 ℃為該菌株的最適濃度范圍。在溫度為40 ℃時，由于環(huán)境溫度過高，菌株的蛋白質(zhì)或核酸發(fā)生變質(zhì)，酶的活性受到影響，從而影響了苯酚的降解效率，同時伴有一部分菌株的死亡。

圖5 pH對苯酚降解性能的影響

2.3.3 pH對苯酚降解性能的影響

在無菌操作條件下，取對數(shù)期菌株JY按接入到不同的pH培養(yǎng)基中，置入恒溫培養(yǎng)箱進行振蕩培養(yǎng)。初始苯酚含量為1 000 mg/L，接種量為5%，pH分別為3.0，5.0，7.0，9.0，11.0。在30 ℃情況下，恒溫振蕩培養(yǎng)24后，測其剩余苯酚濃度以及OD值，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，該菌株在pH為7.0-9.0之間時，菌株的生長狀況良好，在強酸或者強堿環(huán)境當(dāng)中，菌株的生長狀況受到影響。在pH為7.0時，降解率達到最高，計為93.46%。那么為保證良好的降解性能，在實際進行水處理時，pH最好調(diào)節(jié)到7.0左右。

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速對苯酚降解性能的影響

在無菌操作條件下，取對數(shù)期菌株JY，按5%的接種量接入到苯酚無機鹽培養(yǎng)基當(dāng)中，置入恒溫培養(yǎng)箱進行振蕩培養(yǎng)。初始苯酚含量為1 000 mg/L，搖床轉(zhuǎn)速為分別為60 r/min，90 r/min，120 r/min，150 r/min，180 r/min。在30 ℃情況下，恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，測其剩余苯酚濃度及OD值，結(jié)果如圖6所示。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對苯酚降解性能的影響

在最開始搖床的轉(zhuǎn)速為60 r/min時，苯酚的降解效率以及菌株的生長速度都較為緩慢，對苯酚的降解率只有1.35%。隨著搖床轉(zhuǎn)速的不斷提高，菌株JY對苯酚的降解率也在不斷的提高。在轉(zhuǎn)速為60 r/min～120 r/min之間時，菌株對苯酚的降解率升高的速度相對較高。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速超過120 r/min時，菌株對苯酚的降解效率的升高速度和增長的速度較之前相對來說較為緩慢，這可能是由于培養(yǎng)基當(dāng)中的溶解氧量已經(jīng)接近或者達到了飽和狀態(tài)。

3 結(jié) 論

高效生物降解工藝的開發(fā)還需要更進一步的獲得高效降解菌，這是因為在實際的煤化廢水處理過程當(dāng)中，各個微生物之間的相互作用也及其復(fù)雜，有競爭也有協(xié)同，對外界環(huán)境改變的適應(yīng)性也都不同。所以，在實驗室獲得的菌株能否在實際的廢水處理當(dāng)中獲得優(yōu)勢，以及與其他微生物相互組合成高效的菌體組合等還需要進一步的進行研究。本文最終篩選出來的苯酚高效降解細菌JY，其與其他微生物的相互作用、底物利用范圍等仍有待研究。

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Isolation and Degradation Characteristics of a Phenol Degradation Bacterium

Yang Shidong，Kong Long，Liao Luhua，Tao Wenxin，Yao Liqiang，Zhang Xingnan

(School of Civil Architecture Engineering,Northeast Electric Power University，Jilin Jilin 132012)

The sludge is taken from the experimental aerobic stage of the simulated coal chemical wastewater treatment plant.Firstly，strains with good tolerance to phenol (JX，JY，JZ) were screened out by enrichment medium containing phenol.Then，a strain (JY) with good degrading ability to phenol was screened from the above three strains by using the inorganic salt medium with phenol as sole carbon source.The culture characteristics and physiological and biochemical characteristics of JX，JY and JZ were observed and identified.The strain JY was determined by 16S rDNA gene sequence.Finally，the strain was identified as Acinetobacter.The effects of the dosage of bacteria，temperature，PH，and the rotation speed on the growth of JY and the degradation rate of phenol were studied.The results showed that the optimal dosage of JY was 3%，the optimum temperature was 30 ℃-35 ℃，the optimum pH was 7.0，and the optimum rotational speed was 120r/min.

Phenol degradation；Corynebacterium；Genetics and genes；Degradation characteristics

2017-03-12

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130206006SF)

楊世東(1978-)，男，博士，副教授，主要研究方向：城市污水生物處理技術(shù)、水處理高級氧化技術(shù).

1005-2992(2017)04-0074-06

X703

A

電子郵箱： 793516890@qq.com(楊世東)；953334012@qq.com(孔龍)；1329689755@qq.com(廖路花)；837800577@qq.com(陶文鑫)；84717305@qq.com(姚麗強)；316738001@qq.com(張星楠)