吳燕升 綜述 高建東 審校

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

成體腎臟干/祖細胞特異性標記分子研究中的爭議

吳燕升 綜述 高建東 審校

目前已有大量研究證實腎臟中干/祖細胞的存在，成為損傷后細胞修復新的研究方向。雖然諸多研究證實了成體腎臟干/祖細胞通過增殖和(或)旁分泌作用保護腎臟損傷，但是對于成體腎臟中是否真實存在促進腎臟發(fā)育和再生的干/祖細胞，學術(shù)界仍存在大量爭議。成體腎臟包囊和腎小管中CD133和CD24雙陽性細胞被認為是成體腎臟干/祖細胞的特異性標記分子，為腎臟細胞損傷后再生提供了可能性。自體腎臟干細胞的體外培養(yǎng)可能會成為慢性腎臟病尤其是終末期腎病一種有前景的治療手段。

成體腎干/祖細胞 分化型小管細胞 包囊 足細胞 腎臟再生

慢性腎臟病(CKD)已成為21世紀人類面臨的全球性公共健康問題。不管何種病因?qū)е碌腃KD,其最終都可能進展為終末期腎病(ESRD)，需要依賴透析或腎移植,消耗巨大資金及衛(wèi)生資源。但透析僅代替了腎臟濾過功能，并不能完成腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、代謝和內(nèi)分泌等其它重要功能；而腎移植則面臨著供體短缺、移植后免疫排斥、手術(shù)并發(fā)癥等諸多問題。尋求新的治療手段,延緩CKD的進展、預防及治療ESRD，已成為當今國際醫(yī)學界臨床和科研工作亟待解決的重要課題。

腎臟再生是指腎損傷后修復以及局部或整體腎單位的再生。因為腎臟結(jié)構(gòu)復雜，腎組織中缺乏新的腎單位發(fā)生的區(qū)域，人類腎臟再生的難度高于任何其他器官。然而在許多研究中已經(jīng)鑒定出用藥物調(diào)控腎臟細胞的方法或是從遺傳學角度促進腎臟再生的方法，腎臟干/祖細胞成為腎臟再生醫(yī)學中最有前景的研究內(nèi)容。本文主要簡介成體腎臟干/祖細胞及其特異性標記分子的研究進展和存在的爭議問題，希望能對腎損傷修復的研究提出新的思考方向。

成體腎臟中干/祖細胞的定位

干細胞是一類具有自我更新、多系分化和高度增殖的細胞。成體腎組織中存在干細胞，是參與腎修復的細胞群，在腎臟修復中起重要作用。與干細胞類似，祖細胞表現(xiàn)出沿著一種或多種特定細胞系分化的潛能。腎臟干/祖細胞代表著腎臟再生和發(fā)育的基本單位[1]。通常，哺乳動物在出生時即失去產(chǎn)生新的腎單位的能力，但是成體腎臟仍保留了通過祖細胞在損傷腎單位進行細胞再生的能力。Osafune[2]認為，成體腎臟祖細胞來源于多能干細胞的分化或重新編程。殘腎干/祖細胞不僅直接參與腎臟損傷后修復的過程，而且具有促進腎臟再生的能力。它們既可直接地分化為腎臟細胞并與殘腎組織融為一體，也可通過旁分泌因子誘導和促進損傷腎臟的再生[3]。

近些年較為公認的是，成體腎臟干/祖細胞分散在腎小管尤其是腎單位近端小管S3段的上皮細胞和包曼氏囊中。2013年，Buzhor等[4]用免疫分選技術(shù)，以NCAM1為表面標記靶點，鑒定并描繪了人腎臟類似干/祖細胞特征的細胞群，主要來源于人腎臟上皮細胞。NCAM1+細胞表達于大鼠近端小管S3段，控制間充質(zhì)細胞表型，強烈表達SIX2等干/祖細胞標記蛋白，支持早期的祖細胞特性。2014年，Rinkevich等[5]也提出了鼠科動物腎臟內(nèi)定向分化的祖細胞的存在，并且驅(qū)動腎臟的發(fā)育、維持和再生。同年，日本研究者Kitamura等[6]用來源于成體大鼠腎單位S3段腎臟干/祖細胞在體外構(gòu)建出三維立體腎臟樣結(jié)構(gòu)。當腎臟干細胞團懸浮于細胞外基質(zhì)，在多種細胞因子的參與下，可形成完整的腎臟組織結(jié)構(gòu)，包括腎小球、近曲小管、髓袢、遠曲小管和集合管，但是沒有脈管系統(tǒng)。在沒有腎臟發(fā)育所必需的后腎基質(zhì)和輸尿管芽存在的條件下，腎臟干/祖細胞分化出了腎臟結(jié)構(gòu)，進一步證明了成體腎臟干/祖細胞分散在腎小管，尤其來源于腎單位近端小管S3段的上皮細胞。2015年，F(xiàn)aa等[7]聚焦于新生兒腎臟，認為腎臟干/祖細胞存在于包囊、部分腎小管上皮細胞中，它們正是多種細胞發(fā)育的“水庫”，在成年期也很可能依然存在，這些干/祖細胞即是成體腎單位使死亡細胞“起死回生”的原因所在，這也很可能是成體腎臟同胚胎腎臟一樣逆轉(zhuǎn)腎單位再生的唯一機制。

近年來也有研究表明，成體腎臟干/祖細胞可能定位于分化型腎小管細胞中[8]，其修復損傷的機制在于在“去分化”和“再分化”的過程。腎臟損傷后，分化型的腎小管細胞可增殖、遷移至周圍死亡細胞并取而代之。腎小管細胞在修復損傷的過程中，再生的腎小管細胞發(fā)生的表型改變稱之為“去分化”過程。在健康成年人腎臟中，腎小管細胞是柱狀立方體，表達角蛋白和連接蛋白，構(gòu)成上皮細胞頂。而損傷后再生的腎小管細胞失去了上皮細胞頂，表現(xiàn)出扁平的長方體形態(tài)特征，表達中間絲狀體波形蛋白，獲得了后腎間質(zhì)來源的胚腎干/祖細胞表型。表明腎臟再生首先是腎小管上皮細胞“去分化”，伴隨而來的是小管細胞“再分化”，這時候上皮細胞失去間葉細胞標記物，上皮細胞表型恢復，生理功能恢復[9]。

成體腎臟干/祖細胞存在的爭議

腎臟在穩(wěn)定狀態(tài)下，細胞更新速率過慢，再生能力受限。迄今為止，對腎臟干細胞的研究大多集中在對發(fā)育中的胚腎或者是急性腎損傷中的殘腎，仍無確切證據(jù)證明成體腎臟中干細胞存在。Hartman 等[10]認為，在腎臟完全發(fā)育后，帽狀間質(zhì)/后腎間質(zhì)中已不存在自我更新的祖細胞。他們發(fā)現(xiàn)，小鼠在出生3天后，不僅帽狀間質(zhì)的標記基因SIX2沒有表達，甚至在缺血性損傷后，也沒有SIX2基因的任何活化現(xiàn)象,表明成體腎臟不可能再現(xiàn)帽狀間質(zhì)的腎臟再生通路。Humphreys等[11]也認為，近端小管的損傷修復過程與特異性祖細胞無關(guān)。他們通過研究表明，損傷后新的上皮細胞產(chǎn)生是通過健存細胞的自我復制。在缺血再灌注損傷后所謂的“祖細胞”隨時間延長而減少，它們并沒有增殖也沒有遷移到外部的髓質(zhì)或皮質(zhì)。因此，祖細胞并沒有參與損傷后上皮細胞的修復。

此外，成體腎臟殘存的腎單位中分化型小管細胞增殖并不能形成新的腎單位，Vogetseder等[12]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分化型小管細胞都具有增殖的潛能，不論是正常腎臟細胞的自我更新還是損傷后的修復，都存在著成熟小管細胞對壞死細胞的替代。另一項研究中，Kusaba等[13]通過細胞損傷和修復后的克隆分析表明小管內(nèi)并無干/祖細胞群存在的證據(jù)，是終末分化的上皮細胞在損傷后誘導去分化和修復期間再表達了干細胞標記物。

而研究者們所分離出來的“祖細胞”，實際上很有可能是分化細胞。第一，成體腎臟中分化型細胞表現(xiàn)出類似干/祖細胞增殖克隆和自我更新的特性，這可能成為了研究者們誤認為是干/祖細胞的主要原因。第二，體外培養(yǎng)細胞研究顯示，在上皮細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)期間，已分化的上皮細胞會發(fā)生非特異性表型改變，雖然這些細胞顯示出了明顯的增殖和遷移特性，但是它們的本質(zhì)很有可能是纖維原或間充質(zhì)細胞，缺乏功能上的相關(guān)性。第三，使用鑒別干細胞的細胞表面標記分子和功能參數(shù)與已分化的細胞類型重疊，或僅僅是分化型細胞的標記物。第四，缺乏對所謂的“祖細胞”實驗設計的合理控制，也可能造成了誤解[14]。雖然腎臟損傷后，腎臟發(fā)育的某些基因確實被上調(diào)，部分地再現(xiàn)了腎臟發(fā)生的過程，可能指示出成體腎臟祖細胞的存在，但是這樣的細胞數(shù)量太少不能夠達到腎臟再生和修復腎損傷的可測量標準。

CD133+和CD24+在成體腎干/祖細胞的特異性表達

在人類成體腎臟中，腎祖細胞發(fā)育未完全，表現(xiàn)出定向分化成足細胞或小管上皮細胞的潛能[15]。Lindgren等[16]在成年人腎臟組織中分離出了一群高表達乙醛脫氫酶的細胞群，這被認為是多種器官系統(tǒng)中干/祖細胞的共同特征。通過乙醛脫氫酶基因表達譜和腎皮質(zhì)組織免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，有一些數(shù)量十分稀少的細胞群分散在健康成年人腎臟近端小管的上皮層，它們共表達CD133和CD24,這兩個標記物有選擇地表現(xiàn)出包曼氏囊中干/祖細胞的特征。

CD133是主要用來鑒定器官和腫瘤組織中干/祖細胞的表面抗原，已被證明表達于小鼠和人類終末分化的上皮細胞極頂部，尤其是腎臟近端小管部分。CD133+細胞來源于正常成年人腎臟的多能祖細胞，具有增殖和自我更新的潛能。研究發(fā)現(xiàn)，成人腎間質(zhì)中可分離出CD133+細胞群，能高度增殖并產(chǎn)生內(nèi)皮細胞和上皮細胞表型和功能特點，是成體腎臟再生的來源[17]。Kusaba等[13]通過基因譜系分析證明CD133是小鼠近端小管損傷修復過程中上皮細胞去分化的特異性標記物。CD24是表達于人后腎間質(zhì)的表面分子，它也表達于許多腫瘤組織中，如胰腺癌腫瘤干細胞，在糖基化作用下與細胞膜聯(lián)接并通過磷脂酰肌糖轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)[18]。CD133+細胞在人類腎臟發(fā)育過程中是CD24+細胞的子集。在成體腎臟干/祖細胞中，CD133與CD24總是共表達的[19]。包囊中位于尿極表達CD133、CD24，但不表達PDX(足細胞標志蛋白)的祖細胞(CD133+CD24+PDX-)可再生小管細胞和足細胞，而細胞位于尿極與血管極之間，既表達祖細胞標記物CD133、CD24，又表達足細胞標記物PDX(CD133+CD24+PDX+)，只能再生足細胞[20]。而小管祖細胞以低水平表達CD133和CD24為特征，能夠增殖和分化成為近端小管細胞、亨利套、遠端小管細胞，從而起到腎損傷的修復作用[21]。小管祖細胞區(qū)別于包囊祖細胞的特征是在于它們不表達CD106(血管黏附分子1)，即CD133+CD24+CD106+的祖細胞可分化為足細胞和小管細胞，而CD133+CD24+CD106-的祖細胞只能分化為小管細胞。近端小管S3段祖細胞共表達CD133和CD24可作為近端小管上皮祖細胞特異性標志物[22]。CD133+和CD24+共表達作為小管祖細胞和包囊祖細胞的標記物(圖1)，是具有唯一特征性的，腎單位的其他上皮細胞并不具有這一性質(zhì)。生物信息學描繪了這些CD133+和CD24+細胞轉(zhuǎn)錄組的詳細特征，它們具有抵抗急性腎小管損傷的表型，更重要的是，這些祖細胞共表達上皮細胞和間充質(zhì)細胞表型的特征是獨一無二的[23],在成體腎臟和胚胎腎臟中同樣存在，并且是鑒別胚腎中分化型上皮細胞的主要標記物。

圖1 腎臟包囊和腎小管祖細胞示意圖

CD133+和CD24+細胞被認為是腎臟包囊和小管干-祖細胞的特異性標記物[24]，不少研究者在此基礎(chǔ)上也開展了相應的研究證實，CD133+和CD24+細胞增殖有助于腎損傷的恢復。Grange等[25]發(fā)現(xiàn)CD133+祖細胞在急性腎損傷模型中表現(xiàn)出了與間充質(zhì)干細胞類似的功能特點，能夠促進腎功能恢復、阻止腎小管細胞硬化，刺激殘余細胞增殖和存活，表明人類CD133+祖細胞能夠促進腎臟再生。Ronconi等[26]證明了在成年人腎臟內(nèi)存在CD133+和CD24+的祖細胞群，以精確的序列排列在包曼氏囊內(nèi)、具有多向分化和再生的潛能。向阿霉素腎病小鼠注射CD133+CD24+PDX-的細胞，發(fā)現(xiàn)可減輕蛋白尿，改善慢性腎小球損傷。表明CD133+CD24+PDX-的腎內(nèi)祖細胞可用于治療足細胞損傷、蛋白尿和嚴重腎小球硬化癥。

成體腎臟干/祖細胞保護腎臟的研究

研究表明，小管祖細胞僅占全部小管細胞2%～6%，但是能夠抵抗細胞死亡。當分化型小管細胞死亡時，祖細胞所占比例會迅速上升。急性腎損傷病人細胞再生過程中顯示出明顯的CD133+CD24+CD106-祖細胞的增殖[20]。Cakiroglu等[27]在大鼠急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素(EPO)治療后導致腎血管內(nèi)皮細胞中CD133+CD24+雙陽性細胞顯著增多， 說明EPO能夠加強腎臟內(nèi)皮祖細胞和外周血干細胞的招募起到對急性腎損傷的治療作用。Benigni等[28]向重癥綜合性免疫缺陷小鼠靜脈注射同源CD133+和CD24+細胞，可有助于小管結(jié)構(gòu)的重塑和明顯緩解橫紋肌溶解導致的急性腎損傷。Huang等[29]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠有效地保護5/6腎切除大鼠的腎損傷，上調(diào)HGF,BMP-7,WT-1,Pax2等胚胎標記物的表達及增加CD24+/ CD133+腎干/祖細胞的數(shù)量。因此，淫羊藿苷可能通過促進腎臟干/祖細胞的增殖發(fā)揮了保護腎臟的作用。

Romagnani和Kalluri[30]認為，大多數(shù)受損或壞死的腎小管上皮細胞得以修復是通過成體腎臟中干/祖細胞的作用，故他們提出很可能需要操縱損傷修復過程，減慢纖維應答，使腎干/祖細胞發(fā)揮腎臟再生能力而不是瘢痕形成。Lasagni 等[31]發(fā)現(xiàn)抑制節(jié)段性腎小球硬化癥小鼠模型的Notch通路可改善蛋白尿、減少腎小球足細胞死亡，但是會引起腎小球損傷后再生階段祖細胞增殖的減少。所以，影響腎小球疾病發(fā)病和進展的因素之一就在于Notch通路引起的足細胞死亡和腎祖細胞提供的細胞再生之間的平衡。

小結(jié):隨著CKD發(fā)生率增高，腎臟干/祖細胞的深入研究與臨床實踐無疑成為腎臟病患者的福音。分離并鑒定出成體腎臟干/祖細胞的定位及特性，通過祖細胞定向分化或其他細胞類型的重新編程促進腎單位再生，尋找治療CKD的根本有效治療靶點和時機，仍是一項艱巨的任務。而目前仍缺乏針對成體腎臟干/祖細胞，尤其是慢性腎臟病中干/祖細胞公認的研究成果。要確定成體腎臟干/祖細胞是否真正存在，揭開其修復腎損傷機制，為臨床廣大腎臟疾病患者帶來據(jù)實可靠的治療方案，還需學術(shù)界的持續(xù)努力探索。

1 Davidson AJ.Uncharted waters:nephrogenesis and renal regeneration in fish and mammals.Pediatr Nephrol,2011,26(9):1435-1443.

2 Osafune K.Cell Therapy for Kidney Injury:Different Options and Mechanisms -Kidney Progenitor Cells.Nephron Exp Nephrol,2014,126(2):64.

3 Sallustio F,Serino G,Schena FP.Potential Reparative Role of Resident Adult Renal Stem/Progenitor Cells in Acute Kidney Injury.Biores Open Access,2015,4(1):326-333.

4 Buzhor E,Omer D,Harari-Steinberg O,et al.Reactivation of NCAM1 defines a subpopulation of human adult kidney epithelial cells with clonogenic and stem/progenitor properties.Am J Pathol,2013,183(5):1621-1633.

5 Rinkevich Y,Montoro DT,Contreras-Trujillo H,et al.In vivo clonal analysis reveals lineage-restricted progenitor characteristics in mammalian kidney development,maintenance,and regeneration.Cell Rep,2014,7(4):1270-1283.

6 Kitamura S,Sakurai H,Makino H.Single adult kidney stem/progenitor cells reconstitute three-dimensional nephron structures in vitro.Stem cells,2015,33(3):774-784.

7 Faa G,Sanna A,Gerosa C,et al.Renal physiological regenerative medicine to prevent chronic renal failure:Should we start at birth? Clin Chim Acta,2015,(44):156-162.

8 Wen X,Murugan R,Peng Z,et al.Pathophysiology of acute kidney injury:a new perspective.Contrib Nephrol,2010,165:39-45.

9 Bonventre JV.Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.J Am SocNephrol,2003,14(Suppl l):S55-S61.

10 Humphreys BD,Valerius MT,Kobayashi A,et al.Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.Cell Stem Cell,2008,2(3):284-291.

11 Humphreys BD,Czerniak S,DiRocco DP,et al.Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(22):9226-9231.

12 Vogetseder A,Picard N,Gaspert A,et al.Proliferation capacity of the renal proximal tubule involves the bulk of differentiated epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol,2008,294(1):C22-C28.

13 Kusaba T,Lalli M,Kramann R,et al.Differentiated kidney epithelial cells repair injured proximal tubule.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(4):1527-1532.

14 Pleniceanu O,Harari-Steinberg O,Dekel B.Concise Review:Kidney Stem/Progenitor Cells:Differentiate,Sort Out,or Reprogram? Stem cells,2010,28:1649-1660.

15 Angelotti ML,Ronconi E,Ballerini L,et al.Characterization of renal progenitors committed toward tubular lineage and their regenerative potential in renal tubular injury.Stem Cells,2012,30(8):1714-1725.

16 Lindgren D,Bostr?m AK,Nilsson K,et al.Isolation and characterization of progenitor-like cells from human renal proximal tubules.Am J Pathol,2011,178(2):828-837.

17 Bussolati B,Bruno S,Grange C,et al.Isolation of renal progenitor cells from adult human kidney.Am J Pathol,2005,166(2):545-555.

18 Nosrati A,Naghshvar F,Maleki I,et al.Cancer stem cells CD133 and CD24 in colorectal cancers in Northern Iran.Gastroenterol Hepatol Bed Bench,2016,9(2):132-139.

19 Romagnani P,Remuzzi G.CD133+ renal stem cells always co-express CD24 in adult human kidney tissue.Stem Cell Res,2014,12(3):828-829.

20 Wang HL,Liu NM,Li R.Role of adult resident renal progenitor cells in tubular repair after acute kidney injury.J Integr Med,2014,12(6):469-475.

21 Romagnani P,Lasagni L,Remuzzi G.Nephrons are generated via a series of committed progenitors.Nat Rev Nephrol,2014,10(9):491.

22 Romagnani P,Lasagni L,Remuzzi G.Renal progenitors:an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration.Nat Rev Nephrol,2013,9(3):137-146.

23 Romagnani P.Renal Progenitor of Bowman’s Capsule and Its Tubular Brothers.Am J Pathol,2011,178(2):490-493.

24 Winyard PJ,Price KL.Experimental renal progenitor cells:repairing and recreating kidneys? Pediatr Nephrol,2014,29(4):665-672.

25 Grange C,Moggio A,Tapparo M,et al.Protective effect and localization by optical imaging of human renal CD133 +,progenitor cells in an acute kidney injury model.Physiol Rep,2014,2(5):e12009.

26 Ronconi E,Sagrinati C,Angelotti ML,et al.Regeneration of Glomerular Podocytes by Human Renal Progenitors.J Am Soc Nephrol,2009,20(2):322-332.

27 Cakiroglu F,Enders-Comberg SM,Pagel H,et al.Erythropoietin-enhanced endothelial progenitor cell recruitment in peripheral blood and renal vessels during experimental acute kidney injury in rats.Cell Biol Int,2016,40(3):298-307.

28 Benigni A,Morigi M,Rizzo P,et al.Inhibiting angiotensin-converting enzyme promotes renal repair by limiting progenitor cell proliferation and restoring the glomerular architecture.Am J Pathol,2011,179(2):628-638.

29 Huang Z,He L,Huang D,et al.Icariin protects rats against 5/6 nephrectomy-induced chronic kidney failure by increasing the number of renal stem cells.BMC Complement Altern Med,2015,15:378.

30 Romagnani P,Kalluri R.Possible mechanisms of kidney repair.Fibrogenesis Tissue Repair,2009,26,2(1):3.

31 Lasagni L,Ballerini L,Angelotti ML,et al.Notch Activation Differentially Regulates Renal Progenitors Proliferation and Differentiation Toward the Podocyte Lineage in Glomerular Disorders.Stem cells,2010,28(9):1674-1685.

(本文編輯 逸 沐)

Progress and controversy of specific molecular markers of adult kidney stem-progenitor cells

WUYansheng,GAOJiandong

Departmentofnephrology,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,TCMinstituteofkidneydisease,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicineShanghaiKeyLaboratoryofTraditionalChineseClinicalMedicine(14DZ2273200)，Shanghai201203,China

Many studies support the presence of adult kidney stem-progenitor cells, this area has become a new research direction in kidney damage. Many research provide proofs for adult kidney stem-progenitor cells protecting from kidney damage, but the academic circles still argue the existence of adult kidney stem-progenitor cells which promote kidney development and regeneration. A subset of CD133 and CD24 positive progenitor cells exists in adult kidney tubules and Bowman’s capsule, as the labeled molecules of adult kidney stem-progenitor cells, which provide a real possibility for injured renal tubular cell regeneration. Autologous stem-progenitor cells cultivate in vitro provide a fundamental and promising treatment potentially for patients with chronic kidney disease, especially with ESRD.

adult kidney stem-progenitor cells differentiated tubule cells Bowman’s capsule podocytes kidney regeneration

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.04.012

上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃項目(ZYSNXD-CC-YJXYY)

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎病科,上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)腎病研究所,上海市中醫(yī)臨床重點實驗室(上海，201203)

2016-06-30