Fe3+修飾磁性納米粒子的制備與表征及對卵黃高磷蛋白的吸附作用

陳 嬋，黃 茜*，李珊珊，馬美湖

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

Fe3+修飾磁性納米粒子的制備與表征及對卵黃高磷蛋白的吸附作用

陳 嬋，黃 茜*，李珊珊，馬美湖

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

通過化學共沉法和表面功能化修飾得到硫酸軟骨素鈉和Fe3+負載的磁性納米粒子Fe3O4-CS@Fe3+（CMNP@Fe3+），并對該粒子的形貌等特性進行分析。透射電子顯微鏡觀察顯示CMNP@Fe3+呈尺寸為20 nm的圓球形，分散性較好；磁滯回線結果表明該粒子具有超順磁性；傅里葉變換紅外光譜測定證明硫酸軟骨素鈉和Fe3+已成功修飾在Fe3O4表面。利用磁性納米粒子表面Fe3+與卵黃高磷蛋白的強結合力，建立從蛋黃中磁性分離卵黃高磷蛋白的新方法，并對吸附過程的影響因素進行研究。結果發(fā)現(xiàn)當溶液pH 4.0、底物初始質(zhì)量濃度10 mg/mL、吸附時間180 min時，磁性納米粒子的吸附能力最強。利用動力學模型和等溫吸附模型進行擬合，確定CMNP@Fe3+吸附卵黃高磷蛋白的過程符合偽二級動力學模型和Freundlich等溫吸附模型，并通過模型計算得到吸附平衡時卵黃高磷蛋白的理論吸附量為625.00 mg/g。該研究結果為雞蛋中蛋白質(zhì)實現(xiàn)磁性分離提供了依據(jù)。

卵黃高磷蛋白；磁性納米粒子；磁性分離；硫酸軟骨素；鐵離子

雞蛋蛋黃分為蛋黃漿質(zhì)和蛋黃顆粒兩個部分，卵黃高磷蛋白（phosvitin，PV）是蛋黃中主要的磷蛋白，通過磷酸鈣橋與卵黃脂磷蛋白結合，以復合物的形式存在于蛋黃顆粒中。含量占卵黃蛋白質(zhì)的4%，氨基酸殘基含量217 個，其中絲氨酸124 個，占總氨基酸的56%[1-2]。PV 80%以上的絲氨酸被磷酸化，帶大量負電荷，因此對金屬離子有很強的親和力，能夠螯合Fe3+、清除自由基產(chǎn)生抗氧化的效果[3-4]，同時在生物礦化中起到調(diào)控作用，具有多種生物學功能[5-6]。

從蛋黃中分離PV，首先需要利用高鹽溶液將磷酸鈣橋打斷[7]。因此，PV的分離提取方法主要由鹽析法聯(lián)合其他方法組成。鹽析法聯(lián)合離子交換色譜法是利用10% NaCl溶液對蛋黃顆粒進行鹽析后，再用陰離子交換柱純化，此時PV的回收率達到82.7%[8]。若經(jīng)過低濃度鹽溶液和高濃度鹽溶液兩步鹽析后，采用聚乙二醇6000（PEG 6000）沉淀蛋白，再用陰離子交換柱純化，此時得到的PV純度達到99%[9]。這種方法能獲得高純度的蛋白，但反復鹽析、透析的過程十分費時，不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。由于PV具有良好的熱穩(wěn)定性，有研究利用高濃度鹽溶液鹽析和90 ℃熱輔助提取PV。這種方法環(huán)保健康，也能獲得較大的蛋白提取量，只是蛋白的純度都在90%以下[10-11]。鹽析聯(lián)合超濾法提取則是使用10% NaCl溶液對蛋黃顆粒進行處理后，經(jīng)過10 kD和30 kD的超濾膜濃縮、脫鹽，收集得到的PV經(jīng)過變性凝膠電泳——十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，除了目標蛋白條帶外，還有其他蛋白條帶[12]。此外還可以利用乙醇溶液兩次處理蛋黃顆粒，再使用鹽溶液鹽析提取PV[13]。這種方法能夠在鹽析前除去大部分脂蛋白。

PV含有大量磷酸化的絲氨酸，使分子攜帶負電荷，對金屬陽離子有很強的親和力，結合后非常穩(wěn)定[14]，其中以Fe3+與PV的結合能力最強，即使在110 ℃條件下加熱20～40 min，螯合的Fe3+也不會釋放出來。這種螯合金屬離子能力超過了檸檬酸、轉鐵蛋白，只有利用乙二胺四乙酸才能使PV螯合的Fe3+釋放[15-16]。由于PV在食品加工、化妝品、生物材料等領域有很大的市場潛力，因此，利用Fe3+與PV的強結合力，建立一種PV的提取方法很有意義。

采用磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）為輔助，進行分離純化的方法，近年來也有較多的研究。銀杏酸、黃岑中黃酮類、環(huán)三萜類化合物等都是具有鄰位酚羥基和羧基結構的天然成分。這種結構的化合物能夠被Fe3O4納米粒子進行特異性吸附，再利用不同的洗脫液進行洗脫，就能得到不同的目標成分[17-18]。Fe3O4@SiO2@MIP納米粒子磁性分離紫衫中的4 種紫杉烷化合物并進行洗脫收集，能夠為紫杉烷類抗腫瘤、抗癌藥物生產(chǎn)提供大量原料，降低了原料提取的時間成本和經(jīng)濟成本[19]。磁性分離還能夠應用于蛋白質(zhì)組學研究中低豐度蛋白質(zhì)或多肽的提取，解決低含量物質(zhì)難以提取的問題，Ti4+-NTA-PEG@Fe3O4能高效富集酪蛋白水解磷酸肽[20]。其中利用磁性微球進行分離提取磷酸肽已有報道[21]，但是磁性微球對PV的分離鮮有報道。本實驗利用PV與Fe3+的強結合特性，應用表面修飾Fe3+的MNPs聯(lián)合鹽析進行前處理，構建一種PV磁性分離的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋原料：品種為白來航，以產(chǎn)蛋48 h以內(nèi)的新鮮雞蛋為原料提取實驗所需的蛋白質(zhì)。

七水硫酸亞鐵、六水氯化鐵、氯化鈉、PEG 6000、乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、氨水、咪唑（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；硫酸軟骨素鈉（sodium chondroitin sulfate，CS） 日本TCI公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 谷歌生物公司；PV純品按照實驗室的方法自制[7]。

1.2 儀器與設備

ALPHA 1-4真空冷凍干燥機 德國Christ公司；3-30K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000紫外分光光度計 美國Thermo公司；RF-5301熒光分光光度計 日本島津公司； D8 Advance X-射線衍射儀德國Bruker公司；Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀美國梅特勒-托利多公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器有限公司；BKT-4500振動樣品磁強計北京澤天偉業(yè)科技有限公司；7000FA 100kV生物透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 功能化磁性納米粒子的制備

參考張婧[22]的方法利用化學共沉法制備Fe3O4磁性納米粒子，控制Fe2+與Fe3+的物質(zhì)的量比為2∶3，加入體積分數(shù)1%的PEG 6000。即將FeSO4?7H2O和FeCl3?6H2O2溶解于水和無水乙醇體積比5∶1的水溶液，并于60 ℃恒溫攪拌均勻，通氮氣除氧30 min。加入體積分數(shù)30%的氨水后產(chǎn)生黑色顆粒沉淀，此時溶液pH＞10，溶液劇烈攪拌10 min。隨后迅速將溫度升至80 ℃，恒溫攪拌1 h。磁性分離出沉淀，多次水洗并凍干得到Fe3O4粉末。

重復上述步驟至加氨水產(chǎn)生黑色顆粒沉淀后，加入3% CS溶液并保持80 ℃攪拌1 h。利用強磁鐵將黑色沉淀從溶液中分離出來，蒸餾水多次清洗沉淀至pH值中性，凍干得到表面修飾CS的Fe3O4-CS（CMNP）。將Fe3O4-CS分散于pH值為5.0的5 mg/mL的FeCl3溶液中，在恒溫搖床作用下達到吸附平衡，多次清洗除去表面多余的溶液，真空干燥得到Fe3O4-CS@Fe3+（CMNP@Fe3+）。

1.3.2 前處理樣品粗PV的制備

人工打蛋，采用分離器分離蛋清和蛋黃，將蛋黃置于濾紙上，小心滾動翻轉，去除蛋黃表面殘留的蛋清液及系帶，用牙簽刺破蛋黃膜，流出的蛋黃液收集到燒杯中。加入2 倍質(zhì)量的蒸餾水稀釋待用。將稀釋溶液在4 ℃中磁力攪拌1 h。15 000×g冷凍離心20 min，去除上層清液，收集沉淀得到蛋黃顆粒[10]。將蛋黃顆粒懸浮于100 g/L NaCl溶液（蛋黃顆粒與NaCl溶液質(zhì)量比為1∶10，pH 7.25），在4 ℃中攪拌過夜。溶液加熱至85 ℃并保持20 min，隨后用雙蒸水透析24 h，在15 000×g冷凍離心15 min，收集上層清液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，4 ℃攪拌1 h并再次離心收集上層清液凍干后保藏[14]。

1.3.3 磁性納米粒子表面吸附PV

稱取適量上述前處理樣品，利用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配成10 mg/mL的樣品溶液（pH 4.0），取5 mL樣品溶液并加入20 mg 的CMNP@Fe3+，利用渦旋振蕩器混合，在30 ℃的恒溫搖床中吸附120 min。用熒光分光光度計測量吸附前后樣品溶液中PV的含量。

建立熒光光譜法檢測溶液中的PV含量：用PV標準品配制梯度質(zhì)量濃度（0.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL）的溶液，以350 nm波長處熒光強度為基準，繪制標準曲線。CMNP@Fe3+吸附能力計算見式（1）[23]。

式中：qe為平衡吸附量/（mg/g）；V為樣品溶液體積/mL；ρ0為溶液初始PV質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρe為吸附平衡時溶液PV的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；m為CMNP@Fe3+的質(zhì)量/g。

1.3.4 功能化磁性納米粒子表征及特性分析

1.3.4.1 透射電子顯微鏡觀察

稱取微量CMNP、Fe3O4、CMNP@Fe3+、CMNP@ Fe3+-PV，分別超聲分散于乙醇中，取一滴混合液滴在銅網(wǎng)上，待乙醇完全揮發(fā)后，將銅網(wǎng)置于透射電子顯微鏡中觀察并拍攝結果。

1.3.4.2 磁學特性分析

稱取30 mg 的樣品粉末（CMNP和Fe3O4），利用振動樣品磁強計得到磁滯回線并計算磁化強度，施加磁場范圍為-6 000～6 000 Oe。

1.3.4.3 X射線衍射分析

利用X射線衍射儀對粉末樣品進行物相分析。將粉末平鋪，在D8 Advance X射線衍射儀上進行衍射分析。測試條件為：Bragg-Brentano衍射幾何，LynxEye陣列探測器，Ni濾波片，Cu Kα（λ=0.154 18 nm），管壓40 kV，管流40 mA，步進掃描，步長0.02°，掃描速率10 °/min。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥樣品和KBr粉末以1∶100（質(zhì)量比）的比例混合，壓片。紅外測定Fe3O4、CS、CMNP和CMNP@Fe3+磁性納米粒子的化學官能團，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.5 溶液pH值對PV吸附量的影響

稱取適量前處理樣品，利用不同pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL樣品溶液，取5 mL樣品溶液并加入20 mg的CMNP@Fe3+，利用渦旋振蕩器混合，在30 ℃的恒溫搖床中吸附120 min。用熒光分光光度計測量吸附前后樣品溶液中PV的含量，CMNP@Fe3+的吸附能力參照式（1）計算。

1.3.6 吸附時間對PV吸附量的影響

探討吸附時間的影響。配制pH 4.0的10 mg/mL醋酸-醋酸鈉樣品溶液，取5 mL樣品溶液并加入20 mg的CMNP@Fe3+，利用渦旋振蕩器混合，在30 ℃的恒溫搖床中吸附不同時間（30、60、90、120、150、180、300 min）。用熒光分光光度計測量吸附前后樣品溶液中PV的含量，CMNP@Fe3+的吸附能力參照式（1）計算。

采用吸附動力學的偽一級動力學模型和偽二級動力學模型對上述吸附過程進行分析。這兩種模型的公式如下，偽一級動力學模型線性表達式為式（2）。

式中：qe為平衡吸附量/（mg/g）；qt為時間t時吸附量/（mg/g）；k1為偽一級動力學模型吸附速率常數(shù)。以lg（qe-qt）對t作圖，通過直線的斜率和截距可以求出k1和理論平衡吸附量qe,cal。

偽二級動力學模型線性表達式見式（3）[24]。

式中：qe和qt同式（2）；k2為Pseudo second-order模型吸附速率常數(shù)。以t/qt對t作圖，通過直線的斜率和截距可以求出k2和理論平衡吸附量qe,cal。

1.3.7 底物初始添加質(zhì)量濃度對PV吸附量的影響

設置前處理樣品添加質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、15、20 mg/mL，其他操作及反應條件同上，探討初始底物質(zhì)量濃度對PV吸附量的影響。并采用吸附等溫模型Langmuir模型和Freundlich模型對吸附過程進行分析。Langmuir等溫模型的線性表達見式（4）[23]。

式中：qe為平衡吸附量/（mg/g）；qmax為吸附劑單分子層最大吸附量/（mg/g）；ρe為吸附平衡時溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；KL為Langmuir等溫吸附平衡常數(shù)/（L/mg）。以ρe/qe對ρe作圖，通過直線的斜率和截距可以求出qmax和KL值。

Freundlich等溫模型的線性表達見式（5）[23]。

式中：qe和ρe同式（4）；KF為Freundlich等溫吸附常數(shù)；1/n為吸附強度，n是常數(shù)，與吸附體系的性質(zhì)有關，反映吸附劑的吸附性能。以ln qe對ln ρe作圖，若得到一條直線，說明這個吸附符合Freundlich等溫吸附模型，根據(jù)直線的斜率和截距求出1/n和KF。

1.3.8 吸附溫度對PV吸附量的影響

其他操作及反應條件同上，探究吸附溫度為20、25、30、35、40 ℃時，CMNP@Fe3+對PV的吸附量的影響。

1.3.9 磁性分離的PV凝膠電泳測定

在外加磁場的作用下將吸附了PV的CMNP@Fe3+磁性納米粒子從溶液中分離，用純凈水清洗數(shù)次后，加入3 mL的咪唑-NaCl溶液（咪唑、NaCl濃度均為2 mol/L，pH 8.0），在37 ℃恒溫搖床上進行洗脫2 h。然后在外加磁場的作用下將CMNP@Fe3+分離出來，而洗脫液經(jīng)過透析后冷凍干燥，得到磁性分離的樣品PV。

利用電泳的方法對磁性分離得到的PV進行鑒定。其中非變性凝膠電泳（Native-PAGE）的具體操作參考張曉維[7]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組實驗進行3 次平行測定取平均值。

2 結果與分析

2.1 功能化磁性納米粒子的微觀形貌表征

圖1 磁性納米粒子的透射電子顯微鏡圖Fig. 1 Transmission electron photomicrographs of magnetic nanoparticles

從圖1A、B可以看到，這些磁性納米粒子都是球形，且表面光滑。未修飾的Fe3O4粒子大量的聚集在一起，而表面修飾CS的粒子相比于Fe3O4而言分散性提高，基本為單層分散。這是由于磁性納米粒子間存在4 種力：范德華力、磁性引力、靜電排斥力和空間位阻[25]。范德華力和磁性引力是磁性納米粒子發(fā)生團聚的作用力，而靜電排斥力和空間位阻是粒子穩(wěn)定存在的作用力。在納米粒子表面進行功能性修飾能夠有效地增強靜電排斥力和空間位阻作用來分散、穩(wěn)定磁性納米粒子。

從圖1C可以看見，經(jīng)過表面功能化修飾上Fe3+后，磁性納米粒子大部分均為規(guī)則圓形，大小較為均一，粒徑一般為20 nm，表面比較光滑，分散性比起未進行修飾的裸Fe3O4粒子有了很大的改善，團聚現(xiàn)象大大減少。圖1D為表面吸附PV后的CMNP@Fe3+透射電子顯微鏡圖，圖中顯示CMNP@Fe3+以兩個至十幾個磁性納米粒子相互團聚后，在表面吸附了一層物質(zhì)。由于PV的高負電性，使得分子內(nèi)部相互排斥，只能呈現(xiàn)細長分子形狀，而不能形成空間球形的結構[10]，因此推測圖中CMNP@ Fe3+的表面覆蓋的一層物質(zhì)為PV分子。

2.2 功能性磁性納米粒子的磁學性能分析

圖2磁性納米粒子的磁滯回線Fig. 2 Hysteresis loops of magnetic nanoparticles

圖2 為各種磁性納米粒子的磁滯回線，可以看出4 條磁性納米粒子的磁化曲線和退磁曲線重合，且4 條閉合曲線都經(jīng)過原點，當磁場強度H為0 Oe時，磁感應強度為0 emu/g，即測試的樣品在外加磁場存在時被磁化，當外加磁場撤去后，樣品不具有磁性，說明樣品具有超順磁性[26]。未修飾的Fe3O4與表面功能化修飾CS、CMNP@Fe3+、CMNP@Fe3+-PV的飽和磁化強度略有差異，其中未修飾的Fe3O4飽和磁感應強度為83.34 emu/g，CS修飾3%的CMNP飽和磁感應強度為80.84 emu/g，CMNP@Fe3+的飽和磁感應強度為75.00 emu/g以及吸附PV的CMNP@Fe3+的飽和磁感應強度為71.80 emu/g。從上述結果中看出，未修飾的Fe3O4的飽和磁感應強度是最高的，當在裸Fe3O4表面進行一層一層的修飾包裹后，飽和磁感應強度逐漸減小，說明Fe3O4表面進行功能化修飾一定程度降低了納米粒子的磁矩，從而降低磁化性能，使磁感應強度小。

2.3 磁性納米粒子的晶體結構分析

采用X射線衍射對裸Fe3O4和表面修飾CS的CMNP進行晶體結構分析，結果如圖3所示。在0～80°范圍內(nèi)能看到Fe3O4的6 個特征峰（2θ=30.2°、35.6°、43.2°、53.4°、57.1°、62.5°），分別對應Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）晶面[27]。而表面修飾CS的CMNP的譜線2θ在相同的位置（2θ=30.2°、35.6°、43.2°、57.1°、62.5°）也能觀察到對應特征峰的衍射，說明表面修飾CS對磁性納米粒子的晶型沒有影響。與Fe3O4的圖譜相比，CS修飾后的納米粒子衍射強度有所降低，衍射峰寬稍微變大，這是由于在制備粒子的過程中在Fe3O4表面修飾CS，能夠一定程度地阻止晶粒的進一步生長，所以生成較小粒徑的顆粒[28]。

圖3 磁性納米粒子的X射線衍射光譜Fig. 3 X-ray diffraction spectra of magnetic nanoparticles

2.4 磁性納米粒子的傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 磁性納米粒子的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of magnetic nanoparticles

CS中主要含有—OH、—COOH、—NH2官能基團，從圖4可以看到，3 440 cm-1處為O—H和N—H的伸縮振動峰，1 635 cm-1處為C＝O的反對稱伸縮振動峰，1 400 cm-1處為酰胺的C—N伸縮振動峰，1 060 cm-1處為C—O的伸縮振動峰，而Fe—O的主要特征吸收峰在587 cm-1處。進行CS表面修飾修飾后的CMNP傅里葉變換紅外光譜圖在3 440、1 635、1 400、1 060 cm-1處都有吸收峰，說明CS已經(jīng)成功修飾在Fe3O4表面。

而CMNP表面修飾Fe3+后的傅里葉變換紅外光譜圖在3 440、1 624、1 384、1 060、587 cm-1處有CS與Fe—O的特征峰吸收。與之前未修飾Fe3+的CMNP紅外圖進行比較，納米粒子修飾Fe3+后，其中C＝O對應的伸縮振動峰位置從1 635cm-1位移到1 624 cm-1，而C—N的吸收峰位置也從1 400 cm-1位移到1 384 cm-1，并且吸收增強，說明C＝O和C—N參與了Fe3+的偶聯(lián)[29]。

2.5 溶液pH值對PV吸附量的影響

圖5溶液pH值對磁性納米粒子吸附能力的影響Fig. 5 Effect of pH on the adsorption capacity of magnetic nanoparticles

圖5 反映了溶液的pH值對CMNP@Fe3+吸附PV的能力影響比較大。PV的平衡吸附量隨著pH值的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當pH值為4.0時，CMNP@Fe3+對PV的平衡吸附量達到最大。在pH＜4.0時，PV分子表面的負電荷減少，導致PV平衡吸附量減少；當pH＞4.0時，雖然PV表面的負電荷較多，但CMNP@Fe3+表面的Fe3+基團處于較高pH值環(huán)境中時，F(xiàn)e3+發(fā)生水解，掠奪弱酸或水中的OH-，而與OH-結合后，所在位點就不能與PV結合，所以PV的平衡吸附量隨著pH值升高而減少。有研究表明，在酸性條件下，若PV與Fe3+反應時間延長，PV螯合Fe3+的能力不斷增加。由于兩者有更長的接觸時間，部分質(zhì)子化的磷酸酯基團被附近的Fe3+誘導，質(zhì)子解離，而PV的磷酸基團與Fe3+形成更穩(wěn)定的復合物[16]。因此，CMNP@Fe3+對PV進行等電點吸附時，粒子的吸附能力最強，此時吸附量達到最大[30]。

2.6 吸附溫度對PV吸附量的影響

圖6 吸附溫度對磁性納米粒子吸附能力的影響Fig. 6 Effect of temperature on the adsorption capacity of magnetic nanoparticles

不同的吸附溫度對PV吸附量影響的結果如圖6所示，CMNP@Fe3+對PV的平衡吸附量與吸附溫度呈正相關。吸附溫度為20 ℃時，PV平衡吸附量最小448.90 mg/g，隨著溫度的上升，PV平衡吸附量也不斷增加，在實驗溫度范圍中，PV平衡吸附量在吸附溫度為40 ℃時達到最高。吸附行為發(fā)生在CMNP@Fe3+粒子的表面，溫度越高分子運動速度越快，能夠與CMNP@Fe3+有效接觸的PV分子數(shù)量增多，有利于結合的發(fā)生，說明溫度升高對吸附過程有利。但是為了保持PV的生物活性，提取的過程需要避免長時間維持過高的溫度，因此選擇30 ℃作為吸附過程的溫度。

2.7 吸附時間對PV吸附量的影響

圖7吸附時間對磁性納米粒子吸附能力的影響Fig. 7 Effect of adsorption time on the adsorption capacity of magnetic nanoparticles

圖7 顯示了吸附時間對PV平衡吸附量的影響，隨著吸附時間的延長，溶液中的PV含量不斷減少，至趨于平穩(wěn)?？梢詫MNP@Fe3+與PV的結合過程分為3 個階段，分別為快速吸附階段、緩慢吸附階段和吸附平衡階段[31]。在0～30 min階段，CMNP@Fe3+表面存在大量的可結合位點，CMNP@Fe3+與PV的結合比較容易，因此PV平衡吸附量快速提高，這屬于快速吸附階段。30～180 min過程中，PV平衡吸附量顯現(xiàn)緩慢增加的趨勢，這是由于CMNP@Fe3+表面結合了大量的PV，表面形成空間位阻，使得可結合位點與PV的結合變得較為困難，進入緩慢吸附階段。當吸附時間到達180 min后，表面的空間位阻讓PV的平衡吸附量不再隨時間延長而繼續(xù)增加，此時達到吸附平衡的階段。

圖8 動力學偽一級（A）和偽二級（B）模型的擬合曲線Fig. 8 Fitted curves of pseudo fi rst-order kinetics (A) and pseudo second-order kinetics (B)

表1 吸附PV過程偽一級模型和偽二級模型相關參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for pseudo fi rst-order and pseudo second-order models

用動力學偽一級模型和偽二級模型擬合0～180 min階段吸附時間對PV吸附量影響的數(shù)據(jù)，得到的擬合曲線如圖8所示，得到相應的動力學模型參數(shù)如表1所示。從計算得到的動力學參數(shù)可知，偽一級動力學模型計算得到的吸附平衡時PV理論吸附量為610.87 mg/g，偽二級動力學模型計算得到的吸附平衡時PV理論吸附量為625.00 mg/g，這兩個值與實際測量的吸附平衡的PV吸附量600.51 mg/g相差不大。而偽二級模型的相關系數(shù)（R2）比偽一級模型的相關系數(shù)大，說明CMNP@Fe3+對PV的吸附行為更符合偽二級動力學模型。較小的k2值說明CMNP@Fe3+對PV的吸附速率較快。本實驗的k2值為0.006 4 g/（mg·min），而Kamran等[30]利用IL-Fe3O4吸附溶菌酶、牛血清白蛋白、肌紅蛋白的動力學過程計算的k2值分別為0.007、0.027、0.011 g/（mg·min），說明本實驗的吸附體系更容易進行。

2.8 底物初始添加質(zhì)量濃度對PV吸附量的影響

圖9 底物初始質(zhì)量濃度對磁性納米粒子吸附能力的影響Fig. 9 Effect of initial substrate concentrationon adsorption capacity of magnetic nanoparticles

由圖9可知，隨著底物初始質(zhì)量濃度的增大，CMNP@ Fe3+對PV的吸附量也隨之增加。在底物PV添加量小于10 mg/mL時，PV平衡吸附量隨著底物初始質(zhì)量濃度的增加而迅速增大；但當?shù)孜锍跏假|(zhì)量濃度到達10 mg/mL后，CMNP@Fe3+對PV的平衡吸附量不再隨底物質(zhì)量濃度的增加而變化，此時達到最大平衡吸附量，為597.88 mg/g。

圖10 吸附等溫模型Langmuir模型（A）和Freundlich模型（B）Fig. 10 Fitted curves of Langmuir model (A) and Freundlich model (B)

表2 吸附等溫模型Langmuir模型和Freundlich模型的相關參數(shù)Table 2 Parameters for Langmuir and Freundlich isotherm models

根據(jù)圖9數(shù)據(jù)進行吸附等溫模型（Langmuir模型和Freundlich模型）的擬合，如圖10所示。并計算出相關參數(shù)，結果見表2。利用Langmuir模型計算得到的PV理論最大平衡吸附量為625.00 mg/g，這個結果與偽二級動力學模型計算得到的平衡吸附量相同，與實際檢測的平衡吸附量（600.51 mg/g）接近，說明這個理論值是可信的。Langmuir模型是一個表面單分子層吸附模型，每個吸附位點對被吸附物質(zhì)有相同的吸附親和力；而Freundlich模型的吸附位點則是能量不相等的，隨著底物初始質(zhì)量濃度的增加，吸附劑表面的吸附物質(zhì)的量也隨之增加[30]。通過R2值的比較，F(xiàn)reundlich模型的R2值大于Langmuir模型的R2值，表明CMNP@Fe3+吸附PV的行為比較符合Freundlich等溫吸附模型。Freundlich模型中的KF值反映了吸附劑CMNP@Fe3+的吸附能力，數(shù)值越高則吸附能力越強。當0.1＜1/n＜0.5時，體系被認為易于吸附，通過計算本實驗的1/n值為0.35，說明在體系中CMNP@Fe3+對PV的吸附是容易發(fā)生的。

2.9 磁性分離的PV的電泳結果

圖11 PV的Native-PAGE圖Fig. 11 Native-PAGE of PV

圖11為磁性分離的PV和PV純品的Native-PAGE結果?？梢钥吹?，泳道2的PV純品電泳圖有兩個條帶，一條為PV的條帶，而另一個為PV亞基的條帶；泳道1中的磁性分離PV電泳圖，在相同的位置也存在兩個條帶，且沒有其他的雜條帶，說明CMNP@Fe3+提取得到的蛋白PV的確是PV分子，而且蛋白純度高。

3 結 論

本實驗以表面功能化修飾Fe3+的磁性納米粒子為吸附材料，構建鹽析聯(lián)合磁性分離PV的方法。透射電子顯微鏡觀察看到裸Fe3O4粒子發(fā)生團聚，形成多層粒子堆疊的大顆粒，而表面修飾CS的CMNP分散性大大提高，粒子以單層分散。X射線衍射結果表明Fe3O4進行表面修飾后不會改變粒子的晶型，而磁滯回線結果證明制備的CMNP、CMNP@Fe3+都具有超順磁性，能應用于后續(xù)磁性分離蛋白質(zhì)。通過紅外光譜的檢測，證明CS、Fe3+已經(jīng)成功修飾在Fe3O4表面，得到了目標的功能化磁性納米粒子。

實驗對CMNP@Fe3+吸附PV過程的影響因素進行了探究，并獲得最佳的條件為：稱取適量的前處理樣品，配制成pH 4.0、初始底物質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，放入磁性納米粒子CMNP@Fe3+，混勻后放入30 ℃的恒溫搖床中吸附180 min，此時CMNP@Fe3+能達到最大平衡吸附PV能力約600.51 mg/g。通過對實驗數(shù)據(jù)進行分析確定CMNP@Fe3+吸附PV的過程符合偽二級動力學模型和Freundlich等溫吸附模型。本實驗建立的磁性分離PV的方法操作比較快速、簡便、綠色環(huán)保，為后續(xù)磁性納米粒子材料分離PV方法的完善提供了理論依據(jù)。但是磁性納米粒子的重復利用性還有待改善，如何在減少磁性納米粒子表面功能基團損耗的同時，維持較高的PV吸附能力，在后續(xù)的研究中可以進一步探討。

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Synthesis and Characterization of Surface-Modif i ed Magnetic Nanoparticles for Phosvitin Adsorption

CHEN Chan, HUANG Xi*, LI Shanshan, MA Meihu
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Functional magnetic nanoparticles Fe3O4-CS@Fe3+(CMNP@Fe3+for short) were prepared by chemical co-precipitation and functional modif i cation with sodium chondroitin sulfate and ferric ion, and their surface morphology was analyzed. CMNP@Fe3+showed a spherical shape with a small diameter of about 20 nm, and they could be well dispersed in aqueous solution as proved by transmission electron microscope. It was found that the nanoparticles had superparamagnetic properties as indicated by the hysteresis loop. Fourier transform infrared spectrum revealed that sodium chondroitin sulfate and Fe3+coated the surface of Fe3O4successfully. This study established a new method to extract phosvitin from hen egg yolk by taking advantage of the strong binding of Fe3+on the surface of magnetic nanoparticles to phosvitin, and we also investigated the factors inf l uencing the adsorption process. The magnetic nanoparticles had maximum adsorption capacity under the following conditions: solution pH 4.0, initial substrate concentration 10 mg/mL, and adsorption time 180 min. The adsorption kinetics of CMNP@Fe3+for phosvitin was better described by a pseudo second-order kinetic model, and the theoretical adsorption capacity at the equilibrium state computed from the model was 625.00 mg/g. The adsorption data were fi t to well the Freundlich isotherm model. This research may provide a reference for protein separation from eggs using magnetic particles.

phosvitin; magnetic nanopaticles; magnetic separation; sodium chondroitin sulfate; ferric ion

10.7506/spkx1002-6630-201715008

TS253.1

A

1002-6630（2017）15-0043-08

陳嬋, 黃茜, 李珊珊, 等. Fe3+修飾磁性納米粒子的制備與表征及對卵黃高磷蛋白的吸附作用[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 43-50. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715008. http://www.spkx.net.cn

CHEN Chan, HUANG Xi, LI Shanshan, et al. Synthesis and characterization of surface-modif i ed magnetic nanoparticles for phosvitin adsorption[J]. Food Science, 2017, 38(15): 43-50. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201715008. http://www.spkx.net.cn

2016-06-27

國家自然科學基金面上項目（31471602）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303084）

陳嬋（1991—），女，碩士研究生，研究方向為蛋品科學與技術。E-mail：295434276@qq.com

*通信作者：黃茜（1984—），女，副教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)食品科學與技術。E-mail：huangxi@mail.hzau.edu.cn