鮑內(nèi)臟多糖的抗氧化活性

王 姣，魏好程，何傳波，馬 英，熊何健,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021）

鮑內(nèi)臟多糖的抗氧化活性

王 姣1，魏好程1，何傳波1，馬 英2，熊何健1,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021）

為研究鮑內(nèi)臟多糖的抗氧化活性，采用體外抗氧化實驗，評價不同化學組成的鮑內(nèi)臟多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和?OH的清除作用，并以人體肝細胞LO2建立過氧化氫損傷模型，探討鮑內(nèi)臟多糖在細胞水平的抗氧化能力。結(jié)果表明：鮑內(nèi)臟多糖CAVP、AVP1、AVP2具有良好的清除體外自由基能力。多糖CAVP、AVP1、AVP2清除DPPH自由基的半抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為1.46、1.74、1.55 mg/mL。其清除?OH的IC50分別為7.14、15.27、8.11 mg/mL。另外，細胞模型法評價結(jié)果顯示，鮑內(nèi)臟多糖CAVP、AVP1、AVP2在質(zhì)量濃度0.5～4.0 mg/mL條件下對肝細胞LO2的H2O2氧化損傷有保護作用，3 種多糖樣品均能顯著提高LO2細胞存活率；CAVP（4.0 mg/mL）、AVP1（0.5 mg/mL）和AVP2（0.5 mg/mL）能極顯著降低氧化損傷時乳酸脫氫酶的釋放；CAVP能極顯著提高LO2細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（4.0 mg/mL）、過氧化氫酶（catalase，CAT）（0.5 mg/mL）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（0.5 mg/mL）活力；AVP1質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，能極顯著提高LO2細胞內(nèi)GSH-Px、SOD活力，顯著提高CAT活力；AVP2分別在質(zhì)量濃度0.5、4.0 mg/mL 時極顯著提高LO2細胞內(nèi)CAT活力；在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，3 種多糖樣品對降低細胞氧化損傷產(chǎn)生的丙二醛（malondialdehyde，MDA）均有顯著作用。因此，鮑內(nèi)臟多糖是一類潛在的抗氧化物，可用于此類功能食品的開發(fā)。

鮑內(nèi)臟；多糖；抗氧化；LO2細胞

引文格式：

王姣, 魏好程, 何傳波, 等. 鮑內(nèi)臟多糖的抗氧化活性[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 115-121. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715019. http://www.spkx.net.cn

WANG Jiao, WEI Haocheng, HE Chuanbo, et al. Antioxidant activity of polysaccharides from abalone viscera[J]. Food Science, 2017, 38(15): 115-121. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715019. http://www.spkx.net.cn

氧化損傷不僅與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[1-3]，還可誘導(dǎo)機體細胞的壞死與凋亡，是人類衰老的重要原因之一。所以，抗氧化研究對于各種氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防與治療以及對人類的抗衰老[4]有著重要的指導(dǎo)和現(xiàn)實意義。

近年來，多糖的生物活性和化學多樣性受到學者關(guān)注。許多從食物中分離得到的多糖類化合物具有清除自由基[5-7]、抑制脂質(zhì)過氧化，抑制亞油酸氧化等抗氧化作用[8-9]，在生物體內(nèi)其抗氧化機理大多與直接清除活性氧和提高抗氧化酶的活性有關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對H2O2誘導(dǎo)的MRC-5人胚肺成纖維細胞的氧化損傷具有保護作用[11]。Xue Changhu等[12]從海帶中提取出的一種低相對分子質(zhì)量的巖藻聚糖能對抗高脂血癥大鼠體內(nèi)的氧化反應(yīng)。不少研究表明，多糖的抗氧化性可能是抗腫瘤、抗衰老等其他活性的作用機制之一。

鮑屬海洋軟體動物，其體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、肝糖、多種氨基酸、維生素、礦物元素[13]及其他生理活性物質(zhì)[14]，不僅具有很高的食用價值，還具有很好的保健功效[15]，因此，鮑的相關(guān)產(chǎn)品深受消費者喜愛，且鮑的養(yǎng)殖與加工產(chǎn)業(yè)也在逐年擴大。然而，在鮑加工中，為避免外觀和口感受到影響，營養(yǎng)成分豐富的鮑內(nèi)臟常被剝?nèi)?，造成了資源的浪費。鮑內(nèi)臟多糖是通過蛋白酶酶解和超濾技術(shù)從廢棄的、約占鮑質(zhì)量15%～25%的內(nèi)臟[16]中分離提取出來的一類大分子活性物質(zhì)，該多糖類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜但具有多種功能特性。目前已有多個研究表明，鮑內(nèi)臟中多糖類化合物具有清除體外自由基的抗氧化作用[17-19]，而其在細胞水平上的抗氧化作用鮮有報道。因此，本實驗同時研究鮑內(nèi)臟多糖在體外和細胞水平的抗氧化作用，建立LO2細胞的H2O2損傷模型，選取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、?OH清除率、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量指標，充分探究和驗證不同化學組成的鮑內(nèi)臟多糖的抗氧化活性差異，為開發(fā)抗氧化功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑內(nèi)臟粗多糖（a b a l o n e v i s c e r a l c r u d e polysaccharide，CAVP）由集美大學食品與生物工程學院功能性食品研究實驗室自制。

DPPH、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；·OH試劑盒、超氧陰離子自由基試劑盒南京建成生物工程研究所；DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、雙抗（青霉素/鏈霉素）、0.25%胰酶 美國Hyclone公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；EVOS倒置顯微鏡 美國AMG公司；DW-FL253低溫冰箱中科美菱公司；M200PRO酶標儀 瑞士Tecan公司；Series Ⅱ Water CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鮑內(nèi)臟多糖的分離純化流程

CAVP樣品→DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換層析→收集0.2、0.6 mol/L NaCl目標洗脫液→透析→旋蒸濃縮→Sephacryl S-300HR柱層析→收集目標洗脫液→冷凍干燥→得到兩個純化組分AVP1、AVP2

1.3.2 鮑內(nèi)臟多糖純化組分性質(zhì)測定

總糖含量的測定：參照GB/T15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》，采用苯酚硫酸法[20]；蛋白質(zhì)含量的測定：參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用微量凱氏定氮法；硫酸根含量的測定：采用明膠比濁法[21]；分子質(zhì)量的測定：采用凝膠滲透色譜-激光光散射分析聯(lián)用技術(shù)[22-25]。

1.3.3 鮑內(nèi)臟多糖清除DPPH自由基能力的測定

配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH-乙醇溶液，分別取2 mL不同樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫條件下放置30 min后，于517 nm波長處測定吸光度。樣品對DPPH自由基的清除率用公式（1）計算。

式中：A0（對照組）為2 mL樣品溶劑+2 mL DPPH溶液的吸光度；AX（測定組）為2 mL樣品溶液+ 2 mL DPPH溶液的吸光度；AX0（調(diào)零組）為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.4 鮑內(nèi)臟多糖清除?OH能力的測定

采用?OH試劑盒進行測定。按說明依次加樣，混勻后37 ℃條件下反應(yīng)1 min，立即加入2 mL顯色劑終止反應(yīng)，混勻室溫條件下靜置20 min，蒸餾水調(diào)零，在550 nm波長處測定其吸光度，因樣品有顏色，需加顏色扣除管，?OH清除率按公式（2）計算。

式中：Ai為樣品對照管在550 nm波長處吸光度；Aj為樣品測定管在550 nm波長處吸光度；A0為調(diào)零組，樣品顏色扣除管在550 nm波長處吸光度。

1.3.5 細胞水平抗氧化實驗

1.3.5.1 鮑內(nèi)臟多糖對LO2細胞生長的影響

取對數(shù)生長期的LO2細胞，稀釋細胞個數(shù)為1×105個/mL，接種于96 孔板，每孔接種100 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液后分組：空白組不加細胞只加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；實驗組為經(jīng)過24 h細胞培養(yǎng)后加入事先用完全培養(yǎng)基配好的不同質(zhì)量濃度的多糖樣品，每個樣品質(zhì)量濃度做6 組平行；正常對照組為用完全培養(yǎng)基代替多糖樣品，3 組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)期間用顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，振蕩5 min，酶標儀490 nm波長處測OD值。通過公式（3）計算細胞存活率。

1.3.5.2 LO2細胞氧化損傷模型的建立

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL細胞接種于96 孔板，每孔接種100 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞培養(yǎng)結(jié)束棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL濃度為0.0（空白組）、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mmol/L的H2O2溶液，H2O2溶液用磷酸鹽緩沖液配制，每個濃度做6 個平行，繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h，用MTT法測定細胞存活情況，通過公式（3）計算細胞存活率。

1.3.5.3 鮑內(nèi)臟多糖對H2O2誘導(dǎo)LO2細胞損傷的保護作用

取對數(shù)生長期的LO2細胞，稀釋細胞個數(shù)為1×105個/mL，接種于96 孔板，每孔接種100 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分組情況：設(shè)置正常對照組、H2O2損傷模型組、實驗組。24 h培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)上清液，實驗組中加入多糖培養(yǎng)基，正常對照組和損傷模型組加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將4 mmol/L H2O2溶液加入實驗組與損傷模型組中培養(yǎng)2 h建立氧化損傷。培養(yǎng)結(jié)束用MTT檢測細胞存活情況，通過公式（3）計算細胞存活率。

1.3.5.4 抗氧化指標的測定

選擇對數(shù)生長期的LO2細胞，稀釋細胞個數(shù)至1×106個/mL，接種于6 孔板中，每孔接種1 mL，進行培養(yǎng)。分組情況：設(shè)立正常對照組、H2O2模型組、CAVP組、AVP1組、AVP2組，VC陽性對照組。細胞經(jīng)過多糖和H2O2處理后，收集細胞和培養(yǎng)液進行各指標（蛋白質(zhì)、LDH、GSH-Px、CAT、SOD、MDA水平）的測定。其中LDH活力、MDA含量直接用上清培養(yǎng)液進行測定，其余指標選用細胞測定。細胞的GSH-Px、SOD、CAT活力、MDA含量各指標的計算以細胞蛋白含量為基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)測定以2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法定量。所有上述測定方法均以南京建成生物研究所試劑盒檢測，操作嚴格按照說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑內(nèi)臟多糖純化組分性質(zhì)分析

CAVP通過DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換層析和Sephacryl S-300HR葡聚糖凝膠柱層析純化后得到兩種多糖組分AVP1、AVP2。通過對兩種多糖的性質(zhì)進行測定，結(jié)果顯示AVP1的總糖含量和硫酸根含量高于AVP2；兩種多糖均含有少量蛋白質(zhì)。AVP1的分子質(zhì)量小于AVP2（表1）。

表1 鮑內(nèi)臟多糖的性質(zhì)Table 1 Chemical properties of abalone visceral polysaccharides

2.2 鮑內(nèi)臟多糖的DPPH自由基清除能力

多糖能夠提供質(zhì)子給DPPH自由基生成穩(wěn)定的化合物，從而具有DPPH自由基的清除能力，表現(xiàn)為在517 nm波長處的吸收減弱，其褪色程度與自由基清除劑的活性相關(guān)[26]。鮑內(nèi)臟多糖清除DPPH自由基的結(jié)果如圖1所示，3 種多糖樣品對DPPH自由基的清除能力較為接近，當樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時開始表現(xiàn)出具有DPPH自由基的清除活性，且其清除活性隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加，當CAVP、AVP2質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，清除率達到80%左右后增長緩慢。比較3 種樣品對DPPH自由基的清除活性發(fā)現(xiàn)，CAVP的DPPH自由基的清除率高于AVP1和AVP2，而AVP2又高于AVP1。

圖1 鮑內(nèi)臟多糖對DPPH自由基的清除作用Fig. 1 DPPH radical scavenging capacity of abalone visceral polysaccharides

鮑內(nèi)臟多糖對DPPH自由基的清除作用回歸方程和半抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值如表2所示，在相同的反應(yīng)體系中，使DPPH自由基的清除率達到50%（IC50），3 種鮑內(nèi)臟多糖樣品需要1.5 mg/mL左右。

表2 鮑內(nèi)臟多糖清除DPPH自由基的回歸方程和IC50Table 2 Regression equations and IC50for DPPH radical scavenging activity of abalone visceral polysaccharides

2.3 鮑內(nèi)臟多糖的?OH清除能力

?OH是國際學者們公認的毒性最強的活性氧自由基，是生物有機體過氧化損傷的主要因素。因此分析樣品對?OH的清除作用對抗氧化的研究起著至關(guān)重要的作用。實驗測得鮑內(nèi)臟多糖清除?OH的結(jié)果如圖2所示，鮑內(nèi)臟多糖均具有較好的?OH清除活性。CAVP對?OH的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加近乎呈近線性增加，最終清除率可達約80%。而兩種純化鮑內(nèi)臟多糖AVP1和AVP2的?OH清除率均只能達到60%左右，之后增長緩慢呈近持平狀態(tài)，但是AVP2在低質(zhì)量濃度0～5 mg/mL范圍內(nèi)對?OH的清除率即可達到60%，表明在低質(zhì)量濃度條件下AVP2與CAVP、AVP1對比抗氧化性能較強。

圖2 鮑內(nèi)臟多糖對?OH的清除作用Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of abalone visceral polysaccharides

鮑內(nèi)臟多糖對?OH的清除作用回歸方程和IC50如表3所示，AVP1的IC50為15.27 mg/mL，CAVP和AVP2僅需要約AVP1的一半的劑量，因此以IC50值來分析樣品對?OH的清除能力，CAVP和AVP2要好于AVP1。

表3 鮑內(nèi)臟多糖清除·OH的回歸方程和IC50Table 3 Regression equations and IC50for hydroxyl radical scavenging capacity of abalone visceral polysaccharides

2.4 鮑內(nèi)臟多糖對H2O2引起LO2細胞損傷的保護作用

2.4.1 鮑內(nèi)臟多糖對LO2細胞生長的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度的鮑內(nèi)臟多糖對LO2細胞生長的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of abalone visceral polysaccharides on LO2 cells growth

由圖3可知，在多糖質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25 mg/mL時，LO2細胞的存活率均在90%以上，細胞增殖率均在20%以下，多糖對細胞生長無顯著增殖或衰亡作用，因此確定以此多糖質(zhì)量濃度范圍進行進一步實驗具有一定的可行性。

2.4.2 LO2細胞氧化損傷模型的建立

篩選H2O2劑量與作用時間的條件是與空白對照組比較達到細胞的半致死率。H2O2對LO2細胞的損傷結(jié)果如圖4所示。隨著H2O2濃度的增加和H2O2作用時間的延長，細胞存活率明顯下降。在H2O2濃度為4 mmol/L，作用時間為2 h時，細胞存活率下降至50%，已達到半數(shù)致死率，因此選擇H2O2濃度為4 mmol/L、作用時間2 h，作為LO2細胞氧化損傷模型條件。

圖4 不同濃度H2O2對LO2細胞相對存活率的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of H2O2 on the relative survival rate of LO2 cells

2.4.3 鮑內(nèi)臟多糖對H2O2損傷LO2細胞的保護作用

圖5 鮑內(nèi)臟多糖對LO2細胞氧化損傷的保護作用Fig. 5 Protective effect of abalone visceral polysaccharides against oxidative damage in LO2 cells

鮑內(nèi)臟多糖對LO2細胞氧化損傷的保護作用結(jié)果如圖5所示，與H2O2損傷模型組相比，CAVP在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時細胞存活率增長至78%，之后隨質(zhì)量濃度的增加細胞存活率相對持平（圖5a）；AVP1和AVP2在質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時細胞存活率開始較損傷模型組有所增長，且隨著質(zhì)量濃度的升高細胞存活率增加（圖5b、c）。統(tǒng)計分析表明，CAVP、AVP1和AVP2均在加樣量0.5 mg/mL時較模型組開始差異顯著性（P＜0.05，P＜0.01），當質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，保護細胞存活率較所選其他質(zhì)量濃度相比最高，且與損傷模型組相比差異極顯著（P＜0.05），選擇加樣質(zhì)量濃度0.5 mg/mL和 4 mg/mL同時進行做后續(xù)指標的測定，比較各樣品間抗氧化指標的差異。

2.4.4 鮑內(nèi)臟多糖對細胞上清中LDH活力的影響

正常細胞經(jīng)由H2O2處理后，細胞膜被破壞從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的LDH釋放。因此，上清液LDH活力的高低可反映出細胞的損傷程度。從圖6可以看出，LO2細胞經(jīng)H2O2損傷后細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著升高，而經(jīng)VC和鮑內(nèi)臟多糖保護的LO2細胞培養(yǎng)液中LDH的含量明顯少于損傷模型組。其中質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的VC對細胞損傷的抑制作用最強，而3 種樣品組間差異不明顯，表明實驗組細胞損傷程度相對較低，鮑內(nèi)臟多糖具有抑制細胞損傷的能力。

圖6 鮑內(nèi)臟多糖對LDH活力的影響Fig. 6 Effects of abalone visceral polysaccharides on LDH activity

2.4.5 鮑內(nèi)臟多糖對細胞內(nèi)GSH-Px、CAT、SOD活力的影響

GSH-Px、CAT、SOD是機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，對催化H2O2分解、維持機體的氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，因此，3 種抗氧化酶活力的高低可同時反映出組織清除自由基的能力[27]。

圖7鮑內(nèi)臟多糖對GSH-Px活力的影響Fig. 7 Effect of abalone visceral polysaccharides on GSH-Px activity

圖7 結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷的LO2細胞中GSH-Px活性較對照組極顯著降低（P＜0.01），VC陽性對照組在兩個質(zhì)量濃度條件下較模型組均具有極顯著提高GSH-Px活力的作用（P＜0.01），而CAVP、AVP1在質(zhì)量濃度達到4 mg/mL條件下才能極顯著提高受損細胞內(nèi)GSH-Px的活力（P＜0.01）。AVP2對提高GSH-Px活力作用效果不顯著（P＞0.05）。

圖8 鮑內(nèi)臟多糖對CAT活力的影響Fig. 8 Effect of abalone visceral polysaccharides on CAT activity

圖8結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷的LO2細胞中CAT活性較正常對照組極顯著降低（P＜0.01），CAVP、AVP2在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL條件下極顯著提高受損細胞內(nèi)CAT活性（P＜0.01），AVP1對CAT活力的提高作用較弱，在質(zhì)量濃度為4 mg/mL條件下受損細胞內(nèi)的CAT活性才顯著升高（P＜0.05），而VC陽性對照組對提高提高細胞內(nèi)CAT活力作用均優(yōu)于鮑內(nèi)臟多糖樣品。

圖9鮑內(nèi)臟多糖對SOD活力的影響Fig. 9 Effect of abalone visceral polysaccharides on SOD activity

圖9 結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷的LO2細胞中SOD活性較正常對照組極顯著降低（P＜0.01），CAVP對提高受損細胞內(nèi)SOD活性作用較強，其次為VC陽性對照組，經(jīng)它們作用后的細胞中SOD活性與模型組相比均呈極顯著增加（P＜0.01），樣品AVP1、AVP2也有相應(yīng)提高SOD活力的能力，表明鮑內(nèi)臟多糖能提高受損細胞中SOD活力，能防止其受損后快速氧化，具有一定的保護能力。

2.4.6 鮑內(nèi)臟多糖對MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的生物標記物之一，幾十年來一直被國內(nèi)外學者用來反映脂質(zhì)過氧化的水平，MDA含量的高低又間接反映了機體細胞受到自由基攻擊的嚴重程度。圖10結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷LO2細胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較正常對照組極顯著增加（P＜0.01），鮑內(nèi)臟多糖對受損細胞過氧化具有保護性能，可降低受損細胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生，在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，樣品CAVP、AVP1和AVP2對降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成具有顯著作用（P＜0.05，P＜0.01），VC對降低脂質(zhì)過氧化作用較強，其MDA的含量幾乎接近正常對照組。

圖10 鮑內(nèi)臟多糖對MDA含量的影響Fig. 10 Effect of abalone visceral polysaccharides on MDA content

3 討論與結(jié)論

抗氧化在細胞水平發(fā)揮作用的機制有很多[28]，其中重要的一點是抗氧化物可以上調(diào)抗氧化酶活性，減少有毒過氧化產(chǎn)物的生成，提高細胞氧化防御體系，增強細胞抗氧化能力。Zhai Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪衍生物可保護被H2O2損傷的靜脈內(nèi)皮細胞，進一步機理分析得出，這種衍生物可增加內(nèi)皮型NO和一氧化氮合酶活性，可以增加SOD和GSH-Px的活性，減少LDH和過氧化產(chǎn)物的釋放，這些指標的變化均減少了細胞凋亡，提高了細胞活力，從而證明川芎嗪衍生物是通過上調(diào)抗氧化酶的活性來發(fā)揮抗氧化與抗凋亡作用；Qiu Lihong等[30]研究抗氧化物黃芪皂苷的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)它可以促進活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶，從而產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮，且一定程度上提高了SOD水平和活力。本實驗細胞水平抗氧化研究結(jié)果表明，H2O2的損傷導(dǎo)致LO2細胞存活率降低，細胞上清液LDH漏出量增多且能夠顯著造成細胞內(nèi)GSH-Px、CAT、SOD的活性降低及細胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增加。但當提前加入VC和鮑內(nèi)臟多糖樣品對細胞進行保護后，可通過上調(diào)細胞內(nèi)GSH-Px、CAT、SOD抗氧化酶活性、減少MDA的生成量，發(fā)揮其抗氧化作用，并且3 種多糖在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可小幅促進肝細胞LO2的增殖。該結(jié)果與之前研究發(fā)現(xiàn)的通過上調(diào)抗氧化物酶活性、減少有毒過氧化產(chǎn)物的生成作用機制相一致，說明3 種鮑內(nèi)臟多糖在細胞水平上均有抗氧化活性，表現(xiàn)為CAVP在提高細胞存活率的作用中效果較純化多糖好，但是兩種純化多糖對于保護細胞膜避免LDH的釋放作用較優(yōu)，而3 種樣品在對提高細胞內(nèi)抗氧化酶活力上均起不同作用，原因可能是具體指標的作用機制與多糖的性質(zhì)結(jié)構(gòu)對細胞作用的差異有關(guān)。

有研究證明，多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是影響其生物活性的重要因素。多糖的活性與支鏈的性質(zhì)密切相關(guān)，如支鏈的多少和取代基的位置等，本實驗鮑內(nèi)臟多糖支鏈的主要取代基為蛋白氨基和硫酸基團，經(jīng)測定CAVP和AVP2的蛋白含量較高，因此推斷其氨基取代基較多，糖-蛋白的復(fù)合疊加效應(yīng)可使其抗氧化活性提高。硫酸化多糖中C4位上的硫酸基變?yōu)镃6位硫酸基，其抗凝血活性完全喪失[31]。鮑內(nèi)臟多糖AVP1中硫酸根含量較多，但并不是活性較高的多糖，可能原因就與其硫酸根位置有一定關(guān)系。多糖分子質(zhì)量過高不利于多糖跨越多重細胞膜障礙進入生物體內(nèi)發(fā)揮活性作用，而分子質(zhì)量過低，會導(dǎo)致無法形成聚合的活性結(jié)構(gòu)，Alban等[32]研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量與硫酸化多糖抗凝血活性之間具有一種啞鈴型的相關(guān)曲線關(guān)系。由此可見，不同多糖產(chǎn)生生物活性的分子質(zhì)量范圍不同，本實驗中粗多糖CAVP分子質(zhì)量范圍寬泛、混合物種類較多、溶解性好、使其生物活性較好。多糖的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對生物活性的影響存在著相關(guān)性，結(jié)構(gòu)決定理化性質(zhì)，從而影響活性。鮑內(nèi)臟多糖的構(gòu)效關(guān)系有待進一步研究。

綜上所述，鮑內(nèi)臟多糖具有一定的抗氧化能力，可有效清除DPPH自由基和?OH，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)提高細胞存活率、改善抗氧化酶的活力、減少過氧化產(chǎn)物生成、對經(jīng)H2O2損傷的LO2細胞具有保護作用。

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Antioxidant Activity of Polysaccharides from Abalone Viscera

WANG Jiao1, WEI Haocheng1, HE Chuanbo1, MA Ying2, XIONG Hejian1,*
(1. College of Food Science and Biotechnology, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China)

The antioxidant capacity of polysaccharides extracted from abalone viscera was studied by measuring their 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl radical scavenging capacity and their ability to protect human liver LO2 cells against H2O2-induced oxidative damage. The results demonstrated that the crude polysaccharide (CAVP) and two purified fractions (AVP1 and AVP2) all had apparent free radical scavenging capacity with a half maximal inhibitory concentrations (IC50) of DPPH radical scavenging activity of 1.46, 1.74 and 1.55 mg/mL, respectively, and an IC50of hydroxyl radical scavenging activity of 7.14, 15.27 and 8.11 mg/mL, respectively. In addition, all three polysaccharides in the concentration range from 0.5 to 4.0 mg/mL could protect LO2 cells against H2O2-induced oxidative damaged as indicated by signif i cantly increased survival rate and CAVP at 4.0 mg/mL, AVP1 at 0.5 mg/mL and AVP2 at 0.5 mg/mL decreased the activity of lactic dehydrogenase (LDH) in cell culture supernatant. CAVP significantly increased the intracellular activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) at 4.0 mg/mL, catalase (CAT) at 0.5 mg/mL and superoxide dismutase (SOD) at 0.5 mg/mL. AVP1 at 4.0 mg/mL resulted in a signif i cant elevation in CAT activity and a highly signif i cant increase in GSH-Px and SOD activities. AVP2 at both 0.5 and 4.0 mg/mL could highly signif i cantly increase CAT activity. All three polysaccharides at 4.0 mg/mL could signif i cantly reduce the content of malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation product. Therefore, abalone visceral polysaccharides could be used as potential antioxidant ingredients in functional foods.

abalone viscera; polysaccharide; antioxidant activity; LO2 cells

10.7506/spkx1002-6630-201715019

TS254.1

A

1002-6630（2017）15-0115-07

2016-06-28

海洋公益性行業(yè)科研專項（201405016）；福建省科技重點項目（2016N0022）；

廈門市科技計劃項目（3502Z20153014）

王姣（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然活性物質(zhì)。E-mail：w.j0131@163.com

*通信作者：熊何?。?968—），男，研究員，碩士，研究方向為天然活性物質(zhì)。E-mail：hjxiong@jmu.edu.cn