HPLC法同時(shí)測(cè)定不同配伍比例黃連-吳茱萸藥對(duì)中4種有效成分的含量

周素芹，李洪兵（1.漣水縣人民醫(yī)院，江蘇淮安 223400；2.淮安市中醫(yī)院，江蘇淮安 223001）

HPLC法同時(shí)測(cè)定不同配伍比例黃連-吳茱萸藥對(duì)中4種有效成分的含量

周素芹1＊，李洪兵2#（1.漣水縣人民醫(yī)院，江蘇淮安 223400；2.淮安市中醫(yī)院，江蘇淮安 223001）

目的：建立同時(shí)測(cè)定黃連-吳茱萸藥對(duì)中4種有效成分含量的方法，探討該藥對(duì)的合理比例。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Welch XB C18，流動(dòng)相為乙睛-1.5 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至5.0）（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.24～44.80 μg/mL（r＝0.999 9）、1.26～31.50 μg/mL（r＝0.999 8）、2.70～81.00 μg/mL（r＝0.999 8）、1.65～49.50 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為98.11%～100.73%（RSD＝1.04%，n＝6）、96.54%～103.47%（RSD＝1.86%，n＝6）、95.49%～102.36%（RSD＝2.05%，n＝6）、97.19%～103.24%（RSD＝2.19%，n＝6）。當(dāng)黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1時(shí)，各成分綜合含量最高。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于不同配伍比例黃連-吳茱萸藥對(duì)中4種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定；該藥對(duì)中黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1較合理。

黃連；吳茱萸；藥對(duì)；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿；鹽酸巴馬??；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；含量測(cè)定

藥對(duì)，是中醫(yī)臨床常用的相對(duì)固定藥味的配伍組合，是中藥配伍應(yīng)用中的基本形式。黃連-吳茱萸藥對(duì)是寒熱配伍的經(jīng)典藥對(duì)，在消化系統(tǒng)疾病的治療中廣泛應(yīng)用[1]。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，其主要有效成分為鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀。有文獻(xiàn)表明，鹽酸巴馬汀具有抗菌作用[2]，鹽酸小檗堿具有抗菌、抗病毒

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：中藥炮制、檢定、制劑。電話：0517-80876010。E-mail：1132962315@qq.com作用[3-4]。吳茱萸具有抗炎、加快肝臟代謝等作用，其有效成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿[5-8]。因此，檢測(cè)鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量對(duì)黃連-吳茱萸藥對(duì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)檢測(cè)上述4種成分的含量，以達(dá)到對(duì)黃連-吳茱萸藥對(duì)進(jìn)行質(zhì)量控制的目的。

1 材料

1.1 儀器

600E型HPLC儀，包括Waters 600E多溶劑輸送系統(tǒng)、Waters在線脫氣機(jī)、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、Waters 2487型雙通道紫外檢測(cè)器、Millennium32色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；SK3200LHC型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；MettlerAG285型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201211）、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)：110732-20150423）、吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)：110802-20141109）、吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)：110802-201306）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；甲醇、乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

黃連、吳茱萸藥材由江蘇漣水縣人民醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)江蘇淮安市中醫(yī)院李洪兵副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：Welch XB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙睛（A）-1.5 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至5.0，B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰計(jì)均≥3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿質(zhì)量濃度分別為0.224、0.126、0.270、0.165 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。取上述單一對(duì)照品溶液各適量，加甲醇適量，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 分別按黃連-吳茱萸比例（m/m）為1∶1、2∶1、1∶2取黃連、吳茱萸共200 g，用水飽和度正丁醇溶解提取2次，合并提取液，置于100 mL量瓶中，加正丁醇定容，搖勻；精密量取50 mL，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容，濾過(guò)，濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0、2.24、11.20、56.00、112.00 μg/mL的系列鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0、1.26、6.30、31.50、94.50 μg/mL的系列鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0、2.70、13.50、67.50、202.50 μg/mL的系列吳茱萸堿對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0、1.65、8.25、24.75、49.50 μg/ml的系列吳茱萸次堿對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見(jiàn)表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為0.68%、1.06%、2.06%、1.57%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液[黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1]適量，分別于室溫下放置0、2、4、12、24、36、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.04%、1.83%、1.97%、1.51%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品[黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1]適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為0.98%、1.29%、1.86%、2.34%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品[黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1]適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

取藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，分別以黃連-吳茱萸比例（m/m）為1∶1、2∶1、1∶2制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝6，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝6，mg/g）

由表4可知，當(dāng)黃連-吳茱萸比例（m/m）為2∶1時(shí)，各成分綜合含量最高。

3 討論

筆者考察了不同色譜柱[Welch XB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）]的分離效果，結(jié)果采用Welch XB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱時(shí)4種成分峰形與分離效果較好，因此選擇上述色譜柱為本試驗(yàn)的色譜柱。

筆者參考已有文獻(xiàn)[9-10]，考察了乙腈-1.5 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至5.0）、乙腈-1.0 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至5.0），并進(jìn)行不同溶液的流動(dòng)相配比組合試驗(yàn)。結(jié)果，以乙睛-1.5 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液（磷酸調(diào)pH至5.0）為流動(dòng)相，梯度洗脫4種成分的峰形分離效果最佳，且4種成分均在35 min內(nèi)出峰完全。

筆者還考察了不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min），不同柱溫（25、30、35℃）條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果，流速為1.0 mL/min、柱溫為30℃時(shí)，4種成分色譜峰可更好分離，同時(shí)可大大節(jié)約溶劑用量。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于不同配伍比例黃連-吳茱萸藥對(duì)中4種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 4 Effective Components in Different Compatibility Proportions of the Couple of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus by HPLC

ZHOU Suqin1，LI Hongbing2（1.Lianshui County People’s Hospital，Jiangsu Huai’an 223400，China；2.Huai’an Hospital of TCM，Jiangsu Huai’an 223001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 4 effective components in the couple of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus，and to investigate rational proportion of the couple.METHODS：HPLC method was adopted. The determination was performed on Welch XB C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-1.5 mmol/L sodium dodecyl sulfate solution（pH adjusted to 5.0 with phosphoric acid）（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 265 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of berberine hydrochloride，martin hydrochloride，evodiamine and rutacarpine were 2.24-44.80 μg/mL（r＝0.999 9），1.26-31.50 μg/mL（r＝0.999 8），2.70-81.00 μg/mL（r＝0.999 8），1.65-49.50 μg mL（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 98.11%-100.73%（RSD＝1.04%，n＝6），96.54%-103.47%（RSD＝1.86%，n＝6），95.49%-102.36%（RSD＝2.05%，n＝6），97.19%-103.24%（RSD＝2.19%，n＝6），respectively.When the proportion of Coptidis Rhizoma-Evodiae Fructus（m/m）was 2∶1，the comprehensive content of each component was the highest.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 4 effective components in different compatibility proportions of the couple of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus.The rational proportion of the couple of Coptidis Rhizoma and Evodiae Fructus is 2∶1.

Coptidis Rhizoma；Evodiae Fructus；Couple；HPLC；Berberine hydrochloride；Martin hydrochloride；Evodia alkaloid；Rutacarpine；Content determination

R927

A

1001-0408（2017）24-3430-03

2016-12-20

2017-05-04）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.34

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)、臨床中藥學(xué)。電話：0517-82318687。E-mail：327887017@qq.com