宮文萍+李建波+李豪圣+宋健民+劉愛峰+曹新有+韓冉+程敦公+趙振東+楊足君+劉成+劉建軍

摘要：在小麥-單芒山羊草雜交種質(zhì)鑒定研究中，尚缺乏可同時(shí)鑒定小麥和單芒山羊草染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)方法。本研究用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH和以（GAA）8為探針的單色FISH分別對小麥-單芒山羊草雙二倍體、中國春-單芒山羊草附加系進(jìn)行分析，建立了可以同時(shí)鑒定小麥和單芒山羊草全部染色體的FISH標(biāo)準(zhǔn)核型。同時(shí)，利用建立的FISH標(biāo)準(zhǔn)核型在1N附加系自交后代材料中發(fā)現(xiàn)了5BS.3BS和5BL.3BL易位，在5N附加系自交后代中發(fā)現(xiàn)5NL端部寡聚核苷酸序列刪除現(xiàn)象，這為研究染色體結(jié)構(gòu)變異與表型變化的關(guān)系等提供了研究材料。此外，還在4N附加系自交后代中發(fā)現(xiàn)4B染色體丟失現(xiàn)象，造成該附加系自發(fā)形成4N（4B）代換系，為誘導(dǎo)產(chǎn)生涉及4N染色體的小麥-單芒山羊草羅伯遜易位系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：單芒山羊草；熒光原位雜交；染色體結(jié)構(gòu)變異；代換系

中圖分類號：S5121：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0012-07

Abstract So far，the cytogenetic approaches for the identification of wheat-Aegilops uniaristata germplasm are lacking. In the present research， Fluorescence in situ hybridization （FISH） using Oligo-pTa535-1 and Oligo-pSc119.2-1 as probes， and FISH using （GAA）8 as probe are performed on wheat-Ae. uniaristata amphiploid and additions. As a result， a standard FISH pattern was established for the identification of all chromosomes of wheat and Ae. uniaristata simultaneously. Meanwhile， chromosome translocations 5BS.3BS and 5BL.3BL were detected in the self-pollinated 1N addition progenies， and oligo-nucleotide sequence deletion was also detected on chromosome arm 5NL of Ae. uniaristata in the self-pollinated 5N addition progenies， providing important material for researching the relationships between chromosome structure variation and phenotypic changes. Moreover，a spontaneously formed wheat-Ae. uniaristata 4N（4B） substitution line was identified by the established FISH karyotype from the self-pollinated 4N addition progenies， making a solid foundation for further inducing wheat-Ae. uniaristata chromosome translocations with chromosome 4N involved.

Keywords Aegilops uniaristata；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome structure aberration； Substitution line

小麥?zhǔn)俏覈?0%～60%城鄉(xiāng)居民的主要口糧，全國年消費(fèi)量約1.05億噸，占全球消費(fèi)量的20%左右。由于人們生活水平和對生活品質(zhì)的要求不斷提高，使得小麥產(chǎn)業(yè)不僅要培育和推廣高產(chǎn)抗病品種，還要培育優(yōu)質(zhì)特色品種，以滿足市場的多元化需求。由于小麥白粉病、條銹病和赤霉病等嚴(yán)重影響小麥生產(chǎn)，加上小麥優(yōu)質(zhì)特色育種種質(zhì)資源有限，因此，發(fā)掘優(yōu)異新基因和創(chuàng)制特異種質(zhì)新資源并將其轉(zhuǎn)移給當(dāng)前小麥?zhǔn)桥嘤嘣←溞缕贩N的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

山羊草屬物種含有小麥育種所需的抗病抗逆和優(yōu)質(zhì)等基因，其中的單芒山羊草抗小麥多種病害[1-4]，具有耐逆性[5]，具有優(yōu)質(zhì)育種潛力[6]，是改良小麥的優(yōu)異基因源。由于小麥與部分山羊草屬物種的親緣關(guān)系非常近，如小麥D染色體來源于粗山羊草[7]，小麥B染色體來源于擬斯卑爾脫山羊草[8-10]，因此，小麥與山羊草屬部分物種容易雜交成功并獲得小麥-山羊草雙二倍體/部分雙二倍體。將山羊草種質(zhì)轉(zhuǎn)移給小麥的常規(guī)步驟是：山羊草雙二倍體/部分雙二倍體與小麥雜交回交獲得染色體附加系，附加系經(jīng)染色體工程誘導(dǎo)獲得代換系，代換系經(jīng)染色體工程誘導(dǎo)成羅伯遜易位系，羅伯遜易位系直接應(yīng)用于小麥育種或再經(jīng)染色體工程誘導(dǎo)成染色體小片段易位系再應(yīng)用于小麥育種。目前，我們已獲得抗小麥條銹病的小麥-單芒山羊草1N附加系和可顯著提高小麥品質(zhì)的小麥-單芒山羊草4N染色體附加系[11]，然而涉及1N和4N染色體的相應(yīng)代換系還未獲得。

小麥-單芒山羊草雙二倍體和全套附加系已經(jīng)被創(chuàng)制出來[11]，并且單芒山羊草基因組的優(yōu)異基因也被進(jìn)行了充分發(fā)掘[12]。然而，目前鑒定小麥背景中單芒染色體的方法十分有限。研究發(fā)現(xiàn)以寡聚核苷酸（GAA）8為探針的單色熒光原位雜交（FISH）可以對小麥背景中的單芒山羊草進(jìn)行區(qū)分，但是不能鑒定小麥全部染色體[13]。以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH可以有效區(qū)分小麥全部A、B和D染色體[14]，但是是否能區(qū)分單芒山羊草1N～7N染色體尚未可知。為此，本研究特以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH和以（GAA）8為探針的單色FISH對小麥-單芒山羊草雙二倍體和附加系進(jìn)行分析，以期建立能夠同時(shí)鑒定清楚小麥及單芒山羊草所有染色體、用于染色體結(jié)構(gòu)變異檢測和可廣泛應(yīng)用小麥-單芒山羊草種質(zhì)資源鑒定的雙色-單色順序FISH方法。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2017年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室和電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)材料小麥中國春（Chinese Spring，簡寫為CS，2n=6x=42，基因組AABBDD）由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院李光蓉教授提供。圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體（TA3401，2n=6x=42，基因組AABBNN）由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心Friebe Bernd教授提供。1N～5N附加系和7N附加系由英國John Inne Centre的Steve Reader教授提供。

試驗(yàn)所用探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1、（GAA）8均由成都瑞信生物公司合成，前兩者序列同文獻(xiàn)[14]。

1.2 染色體制片與原位雜交

將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養(yǎng)皿中，放入22℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中。待種子萌動后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)到4℃冰箱中放置24 h，之后，放入22℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待種子根尖長至1～2 cm時(shí)，剪下根尖，用冰水處理 22～24 h。倒出冰水，用固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，體積比）固定根尖7 d以上，壓片備用。染色體壓片技術(shù)參見文獻(xiàn)[15]，熒光原位雜交方法參見文獻(xiàn)[14，16]，雜交順序?yàn)橄扔霉丫酆塑账崽结極ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對供試材料染色體制片進(jìn)行雙色熒光原位雜交，照相后洗脫Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1的熒光信號，然后再利用探針（GAA）8對同一細(xì)胞進(jìn)行雜交照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-單芒山羊草雙二倍體FISH分析

利用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體進(jìn)行雙色熒光原位雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙色FISH可以一次鑒定清楚圓錐小麥染色體（圖1A），剩余7對單芒山羊草染色體信號各不一致（圖1A），但無法確定其同源群歸屬。因?yàn)椋℅AA）8為探針的單色FISH可以一次鑒定清楚單芒山羊草染色體同源群歸屬[11]，因而本研究對上述雙色FISH染色體制片進(jìn)行信號洗脫，再以（GAA）8對其進(jìn)行FISH分析，確定單芒山羊草染色體同源群歸屬（圖1B）。

為了更好地描述Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1在單芒山羊草染色體上的雜交信號，筆者對單芒山羊草1N～7N染色體FISH圖進(jìn)行了提取處理（圖2）。其中，1N染色體兩端都有較強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1信號（綠色），在長臂末端和近末端有Oligo-pTa-535-1信號（紅色）；2N染色體短臂末端有較弱的Oligo-pSc119.2-1信號，近著絲粒和長臂亞端部均有很強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1信號，著絲粒處和長臂近末端有Oligo-pTa-535-1信號；3N染色體短臂末端有非常強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1信號，長臂末端、近末端有Oligo-pTa-535-1信號；4N染色體短臂末端、長臂末端和長臂近末端均有很強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1信號；5N染色體長臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂近末端和亞端部均有Oligo-pTa-535-1信號；6N染色體短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂末端具有Oligo-pTa-535-1信號；7N染色體短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1信號，長臂近著絲粒和長臂亞端部有較強(qiáng)的Oligo-pTa-535-1信號。

2.2 小麥-單芒山羊草附加系自交后代材料FISH分析

為了研究小麥-單芒山羊草附加系自交后代染色體結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變異，本研究利用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對小麥-單芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代進(jìn)行原位雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥-單芒山羊草2N、3N、5N和7N附加系中所有小麥染色體雜交信號和文獻(xiàn)[14]報(bào)道的完全一致，染色體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)變異，且寡聚核苷酸在染色體上的雜交位置及信號也完全一致，然而，1N附加系自交后代中發(fā)現(xiàn)了5BS.3BS和5BL.3BL易位（圖3A、3B）。小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中發(fā)現(xiàn)1對4B染色體丟失，該附加系自發(fā)形成了4N（4B）代換系（圖3E、3F）。供試的小麥-單芒山羊草附加系中，1N～4N和7N雜交信號和本研究以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針建立的單芒山羊草FISH核型（圖2）完全一致。5N染色體在雙二倍體中長臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂近末端有Oligo-pTa-535-1信號；而在5N附加系自交后代中，染色體5N長臂末端的Oligo-pSc119.2-1信號丟失（圖3C），這說明5N在傳遞過程中寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列發(fā)生了刪除。

利用探針（GAA）8對小麥-單芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代進(jìn)行原位雜交，結(jié)果認(rèn)為除小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中4B染色體丟失外，未發(fā)現(xiàn)其它所有小麥和單芒染色體寡聚核苷酸（GAA）8序列刪除現(xiàn)象，并且其在染色體上的雜交位置和信號強(qiáng)度均未發(fā)生變異（圖3B、3D和3F）。

3 討論與結(jié)論

在單芒山羊草染色體鑒定方面，F(xiàn)riebe等[17]、Badaeva等[18]和Gong等[11]先后建立了不同來源的單芒山羊草染色體C分帶，提供了鑒定單芒山羊草染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，然而，影響該方法穩(wěn)定性的酸、堿、鹽濃度等因素太多，并不適用于所有實(shí)驗(yàn)室。Gong等[11]建立了單芒山羊草染色體（GAA）8為探針的FISH核型，然而，該方法僅能鑒定單芒山羊草染色體，但不能鑒定小麥全部染色體，因而，在小麥-單芒山羊草雜交種質(zhì)鑒定方面不具全面性。雖然單芒山羊草3N染色體特異EST-STS標(biāo)記[19]、1N染色體麥谷蛋白標(biāo)記[20]和1N～7N染色體EST-STS、PLUG和COS標(biāo)記[11]已經(jīng)建立起來，為檢測小麥背景中單芒山羊草染色體提供了檢測方法，但仍不能一次性鑒定清楚小麥-單芒山羊草種質(zhì)的所有染色體。本研究以小麥-單芒山羊草雙二倍體為基礎(chǔ)，建立了以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的可以同時(shí)鑒定小麥和單芒山羊草所有染色體的雙色FISH方法，有效彌補(bǔ)上述研究的不足。不僅如此，本研究建立的雙色FISH方法不僅可用于發(fā)現(xiàn)小麥-單芒山羊草自交后代中的染色體結(jié)構(gòu)變異、序列刪除和染色體丟失等現(xiàn)象（圖3A～3F），還可以廣泛應(yīng)用于小麥-單芒山羊草種質(zhì)篩選與鑒定工作中。endprint

創(chuàng)制可用于小麥育種的小麥-外源物種染色體小片段易位系進(jìn)行小麥遺傳改良是全世界小麥種質(zhì)資源學(xué)家的終極追求。小麥-外源物種染色體單體附加[21]和輻射誘變[22]等方法均是獲得小麥-外源物種染色體小片段易位系的有效方法。然而，前者在不同物種染色體間易位頻率差異大[21，23，24]，后者誘導(dǎo)方法由于必須大量處理材料并且誘變的方向不可控，因此，較多學(xué)者還利用先誘導(dǎo)材料獲得小麥-外源物種羅伯遜易位系[25-27]，再利用ph1b基因誘導(dǎo)羅伯遜易位系獲得小片段易位系的兩步法來達(dá)到誘導(dǎo)目的[28]。利用上述兩步法的關(guān)鍵是獲得小麥-外源物種染色體雙單倍體，或先獲得小麥-外源物種代換系再與普通小麥雜交獲得雙單倍體。本研究利用建立的單芒山羊草FISH核型從小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中篩選鑒定出了自發(fā)產(chǎn)生的4N（4B）代換系。由于單芒山羊草4N染色體導(dǎo)入小麥可以提高小麥面團(tuán)的穩(wěn)定時(shí)間和形成時(shí)間，增加蛋白質(zhì)和濕面筋含量[12]，因此，小麥-單芒山羊草4N（4B）代換系為誘導(dǎo)獲得可用于小麥品質(zhì)育種的染色體小片段易位系提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在小麥遠(yuǎn)緣雜交后代中往往會出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)變異[29-33]。陳雷等[29]發(fā)現(xiàn)1BL/1RS易位染色體在后代傳遞過程中，可以引起小麥染色體6BS端部缺失和染色體1BL端部缺失。Garg等[30]在小麥Vilmorin27-中間偃麥草附加系的兩個(gè)衍生系中發(fā)現(xiàn)1D染色體的長臂發(fā)生斷裂缺失；Tang 等[31]和Fu等[32]在小麥-黑麥雜交種發(fā)現(xiàn)涉及小麥染色體5A、6A、1B、2B、6B、7B、1D、3D 和7D等染色體的結(jié)構(gòu)變異。Garg等[33]發(fā)現(xiàn)小麥-長穗偃麥草1E附加系后代材料1D染色體丟失而自發(fā)形成1E（1D）代換系。本研究發(fā)現(xiàn)1N附加系自交后代中出現(xiàn)了小麥3B和5B染色體整臂易位，還在小麥-單芒山羊草5N附加系自交后代發(fā)現(xiàn)了寡聚核苷酸序列刪除現(xiàn)象。除此之外，在4N附加系后代材料發(fā)現(xiàn)小麥4B染色體自發(fā)丟失現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)的小麥-單芒山羊草種質(zhì)染色體結(jié)構(gòu)變異體為后續(xù)研究染色體結(jié)構(gòu)變異與表型關(guān)聯(lián)分析提供了研究素材。

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