魯 波,包 磊,李美平,沈 寅,任麗芳,張 鵬
(紹興市婦幼保健院,浙江 紹興 312000)
HC2聯(lián)合細胞塊P16技術(shù)在液基細胞診斷中的應用
魯 波,包 磊,李美平,沈 寅,任麗芳,張 鵬
(紹興市婦幼保健院,浙江 紹興 312000)
目的 探討細胞塊免疫組化p16染色聯(lián)合二代雜交捕獲技術(shù)檢測高危型人乳頭瘤病毒在宮頸液基細胞學診斷中的應用價值。方法 選取2015年1月至2016年11月在紹興市婦幼保健院宮頸液基細胞學初檢判讀為上皮內(nèi)病變細胞(NILM)后,取TCT剩余保存液制細胞塊行免疫組化p16染色,同時行二代雜交捕獲檢測的患者156例。結(jié)果 156例宮頸TCT初檢判讀為NILM的患者,HC2檢測均為陽性;運用細胞塊免疫組化P16檢測并復查TCT,宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的檢出率為19.23%(30/156)。結(jié)論 TCT聯(lián)合運用HC2和細胞塊P16技術(shù)可以有效地提高宮頸癌及癌前病變篩查的準確性,減少漏診率。
細胞塊;p16蛋白;液基細胞學;第二代雜交捕獲技術(shù)
宮頸癌是一種發(fā)病率僅次于乳腺癌的婦科第二大惡性腫瘤,近年來在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢且年齡越來越年輕化[1]。得益于液基細胞學技術(shù)的推廣,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降,但由于受到標本現(xiàn)狀、制片水平、閱片經(jīng)驗的限制,薄層液基細胞學檢查(thinprep cytologic test,TCT)會存在一定的漏診率,因此需更加客觀的輔助方法幫助其提高敏感性和特異性[2]。本文通過第二代雜交捕獲技術(shù)(hybrid capture Ⅱ,HC2)聯(lián)合細胞塊P16進行免疫組化技術(shù)取得了較好的效果,現(xiàn)介紹如下。
1.1材料
收集2015年1月至2016年11月紹興市婦幼保健院行宮頸液基細胞學檢查診斷為未見上皮內(nèi)病變細胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM),HC2陽性共計156例。
1.2方法
1.2.1細胞學檢查
宮頸液基細胞學采用美國Cytic公司的Thingpath 2000技術(shù),巴氏染色。細胞學診斷以宮頸/陰道細胞學診斷報告方式(the bethesda system,TBS)(2001)診斷報告模式為標準。
1.2.2細胞塊制備
將TCT殘液倒入10mL玻璃試管,以2 000r/min離心5min后棄上清液,加入2~3mL自制瓊脂后放入離心機中,以1 500r/min離心15min靜置后,用回形針輕輕刮動細胞快使其脫離管壁,用紗布包裹,放入10%中性福爾馬林固定后入脫水機處理,常規(guī)包埋,切片,蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色。
1.2.3第二代雜交捕獲技術(shù)法
利用對抗體捕獲信號的放大和化學發(fā)光信號的檢測,一次性檢測13種高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)型別。步驟如下:①堿性溶液破壞病毒DNA,雙鏈被釋放并分解為核苷酸單鏈;②DNA單鏈與RNA探針結(jié)合為RNA-DNA雜交復合物;③第一抗體(特異性抗體)將RNA-DNA雜交復合物固定在微孔壁上;④結(jié)合有堿性磷酸酶的多個第二抗體與RNA-DNA雜交復合物結(jié)合使信號放大;⑤堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光,判讀光的強弱可確定堿性磷酸酶的含量從而確定RNA-DNA的含量:⑥ 結(jié)果判定:HPV DNA≥1.0pg/mL即判定為陽性。
1.2.4免疫組化P16法
P16抗體及EnVision試劑盒均采自基因有限公司,免疫組化操作步驟按試劑盒說明書進行。陽性判斷標準以上皮細胞核,細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性,陽性細胞數(shù)>5個為陽性。
在156例TCT初步診斷為NILM,最后通過細胞塊P16聯(lián)合HC2結(jié)果,復查TCT發(fā)現(xiàn)不除外高度病變的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion,ASC-H),高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)檢出率為19.23%(30/156),見圖1、圖2和表1。
注:細胞量少,標本滿意度低,鏡下無法顯示異型細胞。
注:制作成細胞塊后HE染色,發(fā)現(xiàn)細胞量多,聚縮成團,可見異型鱗狀細胞。
表1 HC2聯(lián)合細胞塊P16檢測初檢TCT為NILM病例結(jié)果[n(%)]
3.1 TCT檢查優(yōu)缺點及細胞塊技術(shù)的優(yōu)點
TCT檢查是目前國際上較先進的一種宮頸癌細胞學檢查技術(shù),與傳統(tǒng)的宮頸刮片巴氏涂片檢查相比明顯提高了標本的滿意度及宮頸異常細胞檢出率。然而有文獻報道,細胞學診斷與組織學診斷總符合率僅為60%~70%[3],如何增加診斷的準確率減少漏診率是令人關(guān)注的問題,TCT篩查中,部分標本黏液,血液多和上皮細胞少等缺點在制片過程中始終存在(見圖1),而細胞塊技術(shù)能很好的解決這一系列的問題,細胞塊采集細胞多,它能使細胞聚縮成團,細胞的組織碎片經(jīng)高度濃縮后形成組織學模式,細胞分布適中,不會出現(xiàn)重疊現(xiàn)象,經(jīng)過HE染色后結(jié)構(gòu)更為清晰,更易發(fā)現(xiàn)異型細胞,因此在一定程度上彌補了細胞學診斷的局限性(見圖2)。而且細胞塊制片背景干凈,對陽性胞質(zhì)、胞核、胞膜均易識別,更清晰見到組織碎片,可以幫助判斷宮頸病變的嚴重程度。
3.2 HC2在宮頸癌及癌前病變篩查中的優(yōu)勢
眾所周知,HPV持續(xù)感染是子宮頸癌和癌前病變發(fā)生的主要因素,它通過兩個致癌蛋白E6,E7結(jié)合多種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白和信號傳導蛋白,使DNA受損的細胞發(fā)生異常增殖,導致腫瘤形成。HC2是經(jīng)過美國食品和藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA),歐洲CE(Conformite Europeenne,CE)和中國食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration,SFDA)共同認證的檢測技術(shù)[4]。其檢測靈敏度高,特異性好,重復性和客觀性強等特點,能有效的檢測出13種高危型病毒,已經(jīng)成為宮頸癌病因?qū)W篩查方法并已廣泛使用。但其方法是HPV檢測,是病因?qū)W檢測,主要反映患者當前是否感染HPV,并不能實際反映病毒的致癌能力。最近研究也發(fā)現(xiàn),高危型HPV的病毒負荷量增高與宮頸病變的嚴重程度的增加相關(guān),但與宮頸癌的預后關(guān)系目前尚無定論[5]。
3.3 P16蛋白在子宮頸癌及癌前病變中的表達
P16基因蛋白通過與細胞周期蛋白D競爭,特異性結(jié)合CDK4/6并抑制其活性組織細胞進入G/S期,負調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂,從而達到抑癌作用。HPV持續(xù)感染狀態(tài)是Rb基因與其致癌蛋白E7結(jié)合后失活,破壞P16的負反饋,導致P16過表達[6],細胞將持續(xù)增殖形成腫瘤。Juric等[7]研究表明,P16表達與子宮頸癌及癌前病變的發(fā)生起著重要作用。國外已有學者將P16免疫組織化學染色成功得應用于宮頸細胞學[8],認為其診斷高級別宮頸癌前病變的敏感性和特異性都較高。但從實驗數(shù)據(jù)也表明,幾例細胞塊切片上也同樣未見異型細胞,分析原因可能是細胞本身數(shù)量少或者細胞塊面積有限,該切片剛好未包含異型細胞,對此情況要采取多人會診討論,以提高準確性。
因此,通過實驗數(shù)據(jù)表明,HC2和細胞塊P16技術(shù)兩種方法聯(lián)合運用有效地提高了宮頸癌及癌前病變篩查的敏感性和準確性,減少漏診率,能較早的發(fā)現(xiàn)高危人群,做到早發(fā)現(xiàn),早治療,減少早期宮頸癌及癌前病變的發(fā)生發(fā)展。
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[專業(yè)責任編輯:張冠軍]
Application of HC2 combining P16 of cell block in liquid-based cytology diagnosis
LU Bo, BAO Lei, LI Mei-ping, SHEN Yin, REN Li-fang, ZHANG Peng
(ShaoxingMaternityandChildHealthHospital,ZhejiangShaoxing312000,China)
Objective To explore the value of immunocytochemistry P16 of cell block combining hybrid capture Ⅱ (HC2) in testing high-risk HPV in cervical liquid-based cytology. Methods Totally 156 cases whose initial cervical cytology interpretation as negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM) were selected. The remains of liquid of TCT were used to make cell block for immunocytochemistrically P16 test. And the cases accepted HC2. Results HC2 were all positive in 156 patients with cervical cytology interpretation as NILM. Detection rate of high-grade squamous intraepithelial lesion was 19.23% (30/156) by immunocytochemistry P16 of cell block and TCT again. Conclusion TCT together with HC2 and immunocytochemistry P16 of liquid-based cytology cell block can effectively enhance the accuracy of cervical cancer and precancerous lesions screening and reduce missed diagnosis rate.
cell block; protein P16; liquid-based cytology; hybrid capture Ⅱ(HC2)
2017-01-13
魯 波(1983—),男,主管技師,主要從事病理技術(shù)工作。
包 磊,主任醫(yī)師。
10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.046
R711.7
A
1673-5293(2017)08-1023-02