封家旺，金紅巖*，李封賽，顧慶云，李 鼎，楊康林，達娃卓瑪

(1.西藏職業(yè)技術學院，西藏拉薩 850030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，黑龍江哈爾濱 150030)

拉薩市林周縣牦牛乳樣理化指標及乳房炎病原菌的分離鑒定

封家旺1，金紅巖1*，李封賽2，顧慶云1，李 鼎1，楊康林1，達娃卓瑪1

(1.西藏職業(yè)技術學院，西藏拉薩 850030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，黑龍江哈爾濱 150030)

為研究西藏拉薩市林周縣牦牛乳理化指標和乳房炎主要病原菌，采集牦牛乳樣品100份，開展乳理化指標和主要病原菌檢測。采用CMT法篩選隱性乳房炎病例，針對篩選出隱性乳房炎陽性乳樣20份進行病原菌分離鑒定，共分離出11種52株細菌，通過鑒定，其中包含4株凝固酶陰性葡萄球菌，10株金黃色葡萄球菌，2株停乳鏈球菌，2株乳房鏈球菌，1株糞鏈球菌，8株無乳鏈球菌，6株大腸埃希菌，4株真菌。乳房炎63.5%的病例是由鏈球菌、葡萄球菌和大腸埃希菌引起，結果證實，鏈球菌、葡萄球菌和大腸埃希菌是導致林周縣牦牛乳房炎的主要病原菌。

牦牛;乳；理化指標；乳房炎；病原菌

牦牛素有“高原之舟”之稱，通常生活于海拔3 000 m左右的高寒地區(qū)。文獻資料顯示，全國牦牛存欄量1 420余萬頭，分布于西藏、甘肅、新疆、四川和青海等省區(qū)。牦牛乳是西藏各族人民重要的乳品原料和食品，營養(yǎng)豐富，因而為微生物的生長繁殖提供良好的條件，尤其是乳房炎致病菌[1]。但當前涉及牦牛生產(chǎn)性能及乳制品加工方面的報道相對較多，而關于牦牛乳成分和乳房炎致病菌的相關研究報道較少。本研究旨在探究西藏拉薩市林周縣牦牛乳成分并針對病原菌開展深入研究，為牦牛乳的進一步開發(fā)和牦牛乳房炎的防控提供基礎，也可為牦牛的科學養(yǎng)殖提供科學依據(jù)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 乳成分分析儀；超凈工作臺；立式壓力蒸汽滅菌器；恒溫培養(yǎng)箱；生化培養(yǎng)箱；電熱鼓風干燥箱；冰箱；數(shù)控超生波清洗器。

1.1.2 培養(yǎng)基 CMT檢測試劑盒；脫纖羊血瓊脂；營養(yǎng)肉湯；血清肉湯；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱培養(yǎng)基；伊紅美藍培養(yǎng)；高鹽甘露醇培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 分別于松盤、強嘎、卡孜、江熱夏、旁多鄉(xiāng)各采集乳樣20份，共100份。采集乳樣前，使用1 g/L新潔爾滅消毒乳頭，750 mL/L酒精再次消毒，每個乳頭先棄去前3把奶后采集乳樣10 mL左右，收集于滅菌離心管內(nèi)，經(jīng)滅菌后加蓋，標記編號，置于冷藏保溫容器內(nèi)，盡快送檢[3]。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 將乳樣混合均勻，吸取乳樣250 μL接種于6 mL血清肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h ～36 h。再用接種環(huán)將上述培養(yǎng)物接種于高鹽甘露醇、營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂及TTC-沙堡羅等培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h～48 h。初步觀察菌落形態(tài)后涂片染色鏡檢，細菌類屬判定結合細菌溶血情況，區(qū)分為革蘭陽性桿菌、革蘭陰性桿菌、鏈球菌及葡萄球菌等[4]。然后將細菌進一步純化，增菌備用，鏈球菌接種于50 mL/L血清營養(yǎng)肉湯[5]。

1.2.3 細菌鑒定 將菌株純化培養(yǎng)，進行生化鑒定。通過染色和鏡檢，符合葡萄球菌特性的細菌，用標準金黃色葡萄球菌作為對照，開展兔血漿凝固酶試驗，結合試驗結果區(qū)分為凝固酶陰性葡萄球菌及金黃色葡萄球菌[6]；鏡檢形態(tài)符合鏈球菌的細菌，進行山梨醇、七葉普、馬尿酸鈉、乳糖和甘露醇等生化試驗；將鏡檢形態(tài)符合革蘭陰性桿菌的進行靛基質(zhì)、硫化氫、VP、甘露醇和MR等試驗鑒定[7]。

2 結果

2.1 乳理化指標

檢測樣本20個，乳樣理化指標檢測結果見表1。

2.2 細菌分離培養(yǎng)

結果表明，共分離出11種52株細菌，經(jīng)鑒定，其中包含10株金黃色葡萄球菌，8株無乳鏈球菌，2株乳房鏈球菌，4株凝固酶陰性葡萄球菌，1株糞鏈球菌，2株停乳鏈球菌，6株大腸埃希菌，4株真菌，其中大腸埃希菌、葡萄球菌和鏈球菌為主。

表1 牦牛乳理化指標檢測

2.3 生化試驗鑒定

細菌鑒定結果表明，其中包含2株乳房鏈球菌、8株無乳鏈球菌，1株糞鏈球菌，2株停乳鏈球菌，合計13株鏈球菌，占到總數(shù)的25%；10株金黃色葡萄球菌，占19.2%；4株凝固酶陰性葡萄球菌，占到總數(shù)的7.7%；6株大腸埃希菌，占11.5%；4株真菌，占7.7%。63.4%的乳房炎病例由鏈球菌、葡萄球菌和大腸埃希菌所致(表2)。

表2 牦牛乳中微生物鑒定結果

3 討論

評價牦牛乳營養(yǎng)價值的重要指標是乳理化性狀，也是牦牛育種的重要參考指標，林周縣牦牛乳理化指標檢測結果表明，牦牛乳具有更高的乳脂肪、蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、灰分和乳糖，更宜加工奶酪、酥油和酸奶等乳產(chǎn)品，具有較高的開發(fā)價值[8]。

乳樣病原菌分離鑒定結果顯示，無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和糞鏈球菌檢出率最高，占25%，其次為金黃色葡萄球菌，占19.2%，大腸埃希菌，占總數(shù)的11.5%，再次為凝固酶陰性葡萄球菌，占到總數(shù)的7.7%。上述細菌占總細菌檢出總數(shù)的63.4%，是導致林周縣牦牛乳房炎的主要致病菌。值得一提的是其中兩份隱性乳房炎乳樣未檢出病原菌，究其原因可能是因非病原微生物原因所致，也可能是由其他病原微生物所引起。致病菌的存在，表明林周縣牦牛飼養(yǎng)管理還需加強，否則勢必會影響乳制品質(zhì)量和人民群眾身體健康[9]。因此，進一步完善牦牛飼養(yǎng)管理制度，提高乳生產(chǎn)衛(wèi)生標準十分必要，從源頭上保證牦牛乳質(zhì)量和衛(wèi)生安全，同時為牦牛乳深度開發(fā)利用創(chuàng)造條件[10]。

[1] 席 斌,李維紅,高雅琴.不同地區(qū)牦牛乳營養(yǎng)成分比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(2):1045-1046.

[2] Blum S E,Leitner G.MastitisEscherichiacoli.Genotyping and virulence factors assessment[J].Vet Microbiol,2013,163(3-4):305-312.

[3] Yang J B ,Wen N,Win L F.Month-wise prevalence of subclinical mastitis in dairy cows in Guangdong province,China[J].J Integ Agri,2012,11(1):166-169.

[4] 王禮偉,施研進,屈勇剛,等.新疆石河子地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2014(1):203-206.

[5] Li H M,Ma Y,Li Q M.The chemical composition and nitrogen distribution of Chinese yak (Maiwa) milk[J].Int J Mol Sci,2011,12(8):4885-4895.

[6] 肜豪峰,談重芳.青海湖區(qū)牦牛乳制品的微生物區(qū)系和營養(yǎng)成分的初步研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(7):225-227.

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AnalysisandIdentificationofPhysicochemicalIndexesandMainMastitisPathogensinYakMilkofLinzhouCountyLhasa

FENG Jia-wang1,JIN-hong-yan1,LI Feng-sai2,GU Qing-yun1,LI-ding1,YANG Kang-lin1,DAWA Zhuo-ma1

(1.TibetVocationalTechnolgyCollege,Lhasa,Tibet，850030,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin，Heilongjiang，150030,China)

For further study physicochemical indexes and main mastitis pathogens of yak milk in Linzhou county,Lhasa city of Tibet,100 samples of yak milk were collected to detect milk physicochemical indexes and main pathogens.Recessive mastitis was detected by CMT,the isolation and identification of the pathogens were carried out according to the screened 20 mastitis milk samples.The experiment isolated 11 species(52 strains)of microorganisms,and identified 10 strains ofStaphylococcusaureus,4 strains of coagulase negativeStaphylococcus,8 strains ofStreptococcusagalactiae,2 strains ofStreptococcusdysgalactiae,2 strains ofStreptococcusuberis,1 strain ofStreptococcusfaecalis,6 strains ofEscherichiacoliand 4 strains of fungi.The mastitis caused byStaphylococcus,StreptococcusandEscherichiacoliaccounted for 63.5% of the total.The results showed that the main pathogens of yak mastitis in Linzhou county wereStaphylococcus,StreptococcusandEscherichiacoli.

yak;milk; physicochemical index;mastitis;pathogen

2017-04-22

西藏自治區(qū)高校青年教師創(chuàng)新支持計劃項目(QCZ2016-84);西藏自治區(qū)自然科學基金項目(2015ZR-14-57)

封家旺(1980-)，男，黑龍江肇東人，副教授，博士,主要從事獸醫(yī)學研究。*

S858.23;857.26

:B

:1007-5038(2017)09-0125-04