吳 煜，鄒顯巍，程閏夏

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 (成都 610500)；3.西南醫(yī)科大學(xué)(瀘州 646000)

·論著·

阿托伐他汀對腦出血大鼠腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響*

吳 煜1，鄒顯巍2△，程閏夏3

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 (成都 610500)；3.西南醫(yī)科大學(xué)(瀘州 646000)

目的觀察阿托伐他汀對腦出血大鼠血腫周圍組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響，探討阿托伐他汀對腦出血大鼠的腦保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法將120只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組和治療組。腦出血組和治療組采用自體血立體定向注射法，建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?。假手術(shù)組于相同部位注射等量0.9%氯化鈉注射液。治療組于術(shù)后2 h將阿托伐他汀按10 mg/kg進(jìn)行灌胃。于造模后12 h、1 d、2 d、3 d和5 d分別處死各組大鼠留取腦組織。采用免疫組化法和Western blot法檢測各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β及NF-κB的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，腦出血組TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達(dá)增加(P<0.05),均為12 h開始持續(xù)增加，3 d時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)表達(dá)至5 d；與腦出血組相比，治療組TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論腦出血大鼠血腫周圍腦組織存在NF-κB、TNF-α和IL-1β的高表達(dá)。阿托伐他汀可通過下調(diào)NF-κB信號分子的表達(dá)及炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕腦出血后腦組織的炎癥反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)的作用。

阿托伐他?。荒X出血；NF-κB；TNF-α；IL-1β

腦出血在腦卒中各亞型中發(fā)病率僅次于缺血性腦卒中，居第2位。腦出血在亞洲人、高齡、男性和中低收入國家更普遍。腦出血病死率高(1個(gè)月為40%，1年為54%)，僅12%～39%的患者能實(shí)現(xiàn)長期功能獨(dú)立[1-2]。腦出血致殘致死率均較高，但目前缺乏有效的治療措施。臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，腦出血發(fā)生后，除血腫壓迫引起的機(jī)械性神經(jīng)組織損害外，還存在血腫周邊繼發(fā)性損傷，包括腦組織水腫，炎癥、局部腦血流下降和細(xì)胞凋亡等，其中炎癥反應(yīng)在腦出血繼發(fā)性損害中發(fā)揮重要作用，日益引起重視。本實(shí)驗(yàn)通過觀察阿托伐他汀對腦出血大鼠血腫周圍組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響，明確其對腦出血血腫周圍組織是否有腦保護(hù)功能。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物

健康雄性SD大鼠120只，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量250～300 g。

1.2藥物與試劑

阿托伐他汀鈣片購于輝瑞制藥有限公司。兔抗大鼠NF-κB、TNF-α和IL-1β多克隆抗體，通用型二抗試劑盒及Western blot試劑盒購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。GAPDH兔多克隆抗體購于杭州賢至生物科技有限公司。免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3分組與造模

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、腦出血組和治療組，每組40只。治療組于造模后2 h給予10 mg/kg的阿托伐他汀灌胃， 1次/d。假手術(shù)組和腦出血組在相同時(shí)間給予相同劑量的0.9%的氯化鈉注射液灌胃。制備大鼠腦出血模型。用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠(400 mg/kg)。參考文獻(xiàn)[3-4],將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，調(diào)節(jié)門齒托高度，使大鼠前囟、后囟處于同一水平。沿頭皮正中切10～20 mm切口，無菌操作暴露前囟，用30%的雙氧水燒灼前囟。待前囟燒灼清楚后，定位于前囟前0.4 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進(jìn)針深度為5.5～6.0 mm(即尾狀核位置)。將大鼠尾部消毒，斷尾后用微量進(jìn)樣器取自體血50 μL，迅速將微量進(jìn)樣器通過顱骨鉆孔進(jìn)針到尾狀核位置。用微量泵按15 μL/min注射自體血，留針10 min以防止血液溢出。第2次抽取50 μL自體血，按同樣方法注入尾狀核。注射后留針10 min，緩慢退出微量進(jìn)樣器，用醫(yī)用石蠟封閉骨孔。觀察無出血后縫合皮膚。對照組操作方法同上，只將微量進(jìn)樣器注射到目標(biāo)腦區(qū)，不注射自體血，留針10 min。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照無菌要求進(jìn)行，術(shù)后將大鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4腦出血模型成功評價(jià)

參考Longga 5級評分法對大鼠神經(jīng)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0級：無體征，記0分。1級：動(dòng)物不能完全伸直前肢，記1分。2級：動(dòng)物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分。3級：動(dòng)物不能站立或打滾，記3分。4級：無自發(fā)性活動(dòng)，有意識(shí)障礙記4分。本實(shí)驗(yàn)共造模成功103只，造模失敗17只(術(shù)中不明原因死亡7只，術(shù)后死亡10只。)

1.5WesternBlot分析

從-80 ℃冰箱取各組的腦組織，將尾狀核附近組織剪下約100 mg，倒入少許液氮后研磨成粉末，加入蛋白裂解液裂解1 h，13 000r/min，4 ℃離心15 min，取上清分裝，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠的NF-κB、TNF-α和IL-1β(稀釋濃度均為1∶1 000)，兔抗大鼠的GAPDH(稀釋濃度為1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST漂洗3次，10 min/次。然后用羊抗兔的Ig-G(稀釋濃度為1∶4 000)37 ℃孵育2 h。用TBST漂洗3次后，將條帶放在化學(xué)發(fā)光儀上，按1∶1比例將適量顯影液混勻后滴加在蛋白表達(dá)條帶上進(jìn)行顯影。以Image J軟件對蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度掃描和定量分析。以目標(biāo)蛋白與GAPDH蛋白平均吸光度值(OD值)的比值作為分析對象。

1.6免疫組化

將各組大鼠按不同時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，用4%多聚甲醛固定2 d，將腦組織取出用PBS漂洗3次，加30%蔗糖脫水沉底，OTC包埋劑包埋后用液氮進(jìn)行快速冰凍成塊，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩窈玫慕M織按10 μm厚度進(jìn)行切片。按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織NF-κB的定量表達(dá)

在不同時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組可見少量NF-κB表達(dá)；與假手術(shù)組相比，腦出血組可見大量的NF-κB蛋白表達(dá)(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)治療組NF-κB蛋白表達(dá)量較腦出血組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1～3、表1)。

圖1WesternBlot檢測不同時(shí)間點(diǎn)(12h、1d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達(dá)

2.2實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織TNF-α的定量表達(dá)

在不同時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組中的TNF-α蛋白呈弱表達(dá)；與假手術(shù)組相比，腦出血組的TNF-α蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；治療組與腦出血組相比，TNF-α蛋白的表達(dá)量減少(P<0.05)(圖1～3、表2)。

圖2WesternBlot檢測不同時(shí)間點(diǎn)(2d、3d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達(dá)

圖3WesternBlot檢測不同時(shí)間點(diǎn)(5d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達(dá)

2.3實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織IL-1β的定量表達(dá)

假手術(shù)組可見微量的IL-1β表達(dá)；與假手術(shù)組相比，腦出血組可見大量的IL-1β蛋白表達(dá)(P<0.05)；治療組與腦出血組相比，IL-1β蛋白的表達(dá)量減少(P<0.05)(圖1～3、表3)。

2.4相關(guān)性分析

腦出血后血腫周圍腦組織NF-κB與TNF-α的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(各組r>0，P<0.01);同時(shí)與IL-1β的蛋白表達(dá)水平也呈正相關(guān)(各組r>0，P<0.01)。

表1 腦組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)的定量分析(OD值

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)的定量分析 (OD值

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達(dá)的定量分析 (OD值

注：與假手術(shù)組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

2.5實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織IL-1β的定位表達(dá)

IL-1β陽性細(xì)胞在腦組織中主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕褐色顆粒。假手術(shù)組偶見IL-1β陽性細(xì)胞。腦出血組可見大量IL-1β陽性細(xì)胞，1 d、2 d時(shí)陽性細(xì)胞明顯增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)明顯減少。與相同時(shí)間點(diǎn)的腦出血組相比，治療組中的陽性細(xì)胞明顯減少(圖4)。

2.6實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織TNF-α的定位表達(dá)

TNF-α陽性細(xì)胞呈棕褐色，主要分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。假手術(shù)組可見微量的TNF-α陽性細(xì)胞。腦出血組1 d、2 d時(shí)陽性細(xì)胞持續(xù)增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)明顯減少。與相同時(shí)間點(diǎn)的腦出血組相比，治療組中的陽性細(xì)胞可見大量減少(圖5)。

2.7實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠周圍組織NF-κB的定位表達(dá)

NF-κB陽性細(xì)胞呈棕褐色，主要分布在細(xì)胞核。假手術(shù)組可見極少量的陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，腦出血組NF-κB陽性細(xì)胞明顯增多，1 d、2 d時(shí)陽性細(xì)胞持續(xù)增多，3 d達(dá)高峰，5 d時(shí)明顯減少。與相同時(shí)間點(diǎn)的腦出血組相比，治療組的NF-κB陽性細(xì)胞明顯減少(圖6)。

圖4 腦組織中IL-1β的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400X)

圖5 腦組織中TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400X)

圖6 腦組織中NF-κB p65的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400X)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)就創(chuàng)傷性腦損傷后NF-κB與TNF-α(或IL-1β)的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，NF-κB與TNF-α(或IL-1β)均呈正相關(guān)性，揭示NF-κB 可能正向調(diào)控TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。這可能與腦出血繼發(fā)性損害中出現(xiàn)炎癥反應(yīng)有關(guān)。NF-κB在炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[5]。多種炎癥介質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中存在一個(gè)或多個(gè)κB序列，如IL-8 、IL-6 、TNF-a和VCAM-1等。NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子,活化的NF-κB可單獨(dú)或與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同參與上述介質(zhì)基因的誘導(dǎo)表達(dá)[6-8]。NF-κB猶如炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)開關(guān)，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和黏附分子等的表達(dá)，從而激發(fā)炎癥瀑布反應(yīng)，造成組織損傷。NF-κB可刺激TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)這些細(xì)胞因子又是NF-κB的刺激劑，可進(jìn)一步活化NF-κB，只有激活的NF-κB才能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，從而造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可能從以下幾個(gè)方面起作用：1)減輕炎癥反應(yīng)，他汀類藥物可通過直接減少體內(nèi)炎性介質(zhì)(TNF-α和IL-1β)的表達(dá)或抑制NF-κB的活性，從而減輕神經(jīng)功能損傷。2)抗氧化作用，他汀類藥物具有廣泛的抗氧化作用，減輕腦血管病后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用[13]。孟令麗[14]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路調(diào)控IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低腦組織的含水量，改善神經(jīng)功能損傷，從而減輕腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷，對腦出血大鼠起重要的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)Western blot和免疫組化的結(jié)果顯示，腦出血后給予阿托伐他汀治療，NF-κB和TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平較出血組明顯減少，這可能是NF-κB的活性得到明顯抑制，從而導(dǎo)致TNF-α、IL-1β的合成與釋放大量減少，減慢了腦出血組織周圍炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展。所以阿托伐他汀可能通過抗炎途徑抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，這為阿托伐他汀在腦出血的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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TheEffectofAtorvastatinontheExpressionofNF-κB,TNF-αandIL-1βintheRatswithIntracerebralHemorrhage

WuYu1,ZouXianwei2△,ChengRunxia3.

1.ChengduMedicalCollege,SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;3.SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

ObjectiveTo observe the effect of atorvastatin on the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β in the tissues around the hematoma of the rats with intracerebral hemorrhage and explore the protective effect of atorvastatin on the brain of the rats with intracerebral hemorrhage and its possible mechanism.MethodsA total of120SD rats were randomly divided into the sham group, intracerebral hemorrhage group and treatment group. Both the intracerebral hemorrhage and treatment groups were given the intracerebral injection of autologous blood to establish the models of intracerebral hemorrhage, while the sham group was given the injection with0.9% sodium chloride at the same site. The treatment group was given intragastric administration of atorvastatin at doses of10mg/kg2hours after operation. The rats were sacrificed and their brain tissues were taken in each group after12hours,1,2,3and5days respectively. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the protein expression of TNF-α, IL-1β, and NF-κB in the brain tissue of rats in each group.ResultsCompared with the sham group, the intracerebral hemorrhage group had significant increase in the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β (P<0.05), and the expression began to increase steadily after12hours, reached the peak on the3rd day, and lasted for5days. Compared with the intracerebral hemorrhage group, the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β decreased significantly in the treatment group (P<0.05).ConclusionThe high expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β is involved in the tissues around the hematoma of the rats with intracerebral hemorrhage. Atorvastatin has a protective effect on the brain by reducing the expression of NF-κB signaling molecules, the production of inflammatory cytokines and the inflammatory response of brain tissues.

Atorvastatin； Intracerebral hemorrhage； NF-κB；TNF-α；IL-1β

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170719.1840.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.016

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No:17ZA0314)

：鄒顯巍 E-mail：chinazxw002@163.com

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