賴宣丞，廖長儒，曾德斌

(海南省疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)檢測所理化科,海南 ?？?570203)

免疫親和柱凈化-HPLC法測定植物油中黃曲霉毒素

賴宣丞，廖長儒，曾德斌

(海南省疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)檢測所理化科,海南 海口 570203)

目的： 建立一種免疫親和柱凈化-高效液相色譜同時(shí)測定植物油中黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2的方法。方法： 試樣用甲醇水(55+45，體積比)提取，提取液經(jīng)離心、過濾、稀釋后，用免疫親和柱凈化，采用高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒鈾z測器檢測。結(jié)果： 在優(yōu)化條件下，黃曲霉毒素B1,G1的檢出限分別為0.067μg/kg，黃曲霉毒素B2,G2的檢出限分別為0.02μg/kg,回收率范圍為94.0%～105.7% 。結(jié)論： 該方法簡便快速，靈敏度高，重復(fù)性好，可滿足植物油中黃曲霉毒素含量檢測的需要。

黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2；HPLC；大體積流通池；植物油 液相色譜

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉和模式曲霉等在合適的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在于各類糧油制品中。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，其毒性是氰化鉀的10倍, 砒霜的68倍，也是所有真菌毒素中最穩(wěn)定的一種，對公眾健康有極大的危害。經(jīng)鑒定的黃曲霉毒素有 20 多種，常見的有 B1，B2,G1和G2[1]。當(dāng)人體黃曲霉毒素?cái)z入量大時(shí)，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。

目前檢測黃曲霉毒素的方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MSMS)等。薄層色譜法操作繁瑣、耗時(shí)長、污染大、定量差、靈敏度差; 酶聯(lián)免疫吸附法雖操作簡單, 靈敏度高, 但特異性差、重復(fù)性差, 易出現(xiàn)假陽性。HPLC因其高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)而得到越來越廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的HPLC檢測法需柱前加三氟乙酸或柱后加碘衍生, 實(shí)驗(yàn)中試劑使用較多,衍生過程復(fù)雜、操作繁瑣, 靈敏度及重現(xiàn)性受人為因素影響大[8]。因此，建立一種快速、較環(huán)保的花生油中黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2含量測定方法是十分必要的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國Waters公司超高效液相色譜儀ACQUITY Hclass配熒光檢測器( 帶大體積流通池) ；BS124S電子分析天平；渦旋振蕩器；離心機(jī)

1.2 試劑

黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2混標(biāo)(O2i公司，編號116870-01-1ML，B1濃度為1.003mg /L，B2濃度為0.2979 mg /L，)G1濃度為0.9996 mg /L，G2濃度為0.2976 mg /L，純度為98%) ；黃曲霉毒素總量免疫親和柱 (Pribolab公司，)；甲醇HPLC級(Tedia 公司)；乙腈HPLC級(Tedia 公司)；玻璃微纖維濾紙(Whatman公司)；水為超純水；樣品來源于本檢驗(yàn)所抽驗(yàn)品。

2 方法部分

2.1 色譜條件

色譜柱：太瑋科技ADE-PAKTM ODS-AQ(5μm 250×4.6μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(18:18:64)；激發(fā)波長：362nm，發(fā)射波長：440nm；進(jìn)樣量：10μL；流量：0.5mL/min；柱溫：35℃

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取5.0g樣品，置于50mL離心管中，加入1.0g氯化鈉。加入25.0mL甲醇-水(55:45)。渦旋振蕩，讓樣品與提取液充分混合；振蕩10min，以7000r/min離心10min；取下層提取液玻璃微纖維濾紙過濾。

2.2.2 免疫親和柱凈化

將免疫親和柱連接固相萃取裝置，準(zhǔn)確移取15mL澄清液過免疫親和柱，以每秒鐘一到兩滴的流速淋洗柱子，使2～3mL空氣進(jìn)入親和柱中，重復(fù)淋洗柱子一次，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過柱體。

2.2.3 免疫親和柱洗脫

在固相萃取裝置里面裝上接收瓶，用2.0mL色譜級甲醇分三步進(jìn)行洗脫，重力洗脫。先加0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)，重力過柱，當(dāng)溶劑通過柱子后，等待30s后再加入0.5mL甲醇進(jìn)行洗脫，再次孵育30s以上再進(jìn)行重力洗脫，最后一次加入1.0mL甲醇孵育后進(jìn)行重力洗脫。收集全部洗脫液供檢測用。

2.2.4 液相色譜測定

由低至高濃度順序進(jìn)樣 6 個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣量 10μL，對照標(biāo)準(zhǔn)儲備液中的保留時(shí)間，確定混合工作液中的黃曲霉毒素保留時(shí)間，以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。圖 1 為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖1

3 結(jié)果與討論

3.1 提取條件優(yōu)化

分別采用甲醇-水溶液比例(45:55)、(55:45)、(65:35)提取樣品，通過多次比較，確定甲醇-水比例為55∶45時(shí)，回收率穩(wěn)定在90% ～105% 之間。

3.2 洗脫條件優(yōu)化

SNT 3868-2014[2]中采用分別加兩次0.6mL甲醇進(jìn)行洗脫，但是單純的洗脫不夠完全，定量不準(zhǔn)。經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用三次甲醇洗脫加上孵育(孵育即甲醇在柱子中浸泡)，回收率良好，洗脫完全。

3.3 方法驗(yàn)證

3.3.1 線性范圍

表1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度曲線

按上述色譜條件測定如表1所示濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，結(jié)果顯示，4 種毒素在0 -9.829 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上。

3.3.2 方法檢出限和定量限

以三倍信噪比，按方法的稱樣量和定容體積計(jì)算，則黃曲霉毒素B1、G1的方法檢出限為0.067μg/kg，定量限為0.22μg/kg；黃曲霉毒素B2、G2方法檢出限為0.02μg/kg，定量限為0.067μg/kg。

3.3.3 方法精密度實(shí)驗(yàn)

分別取不同量的黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2與植物油的空白樣品混合，按樣品的處理方法提取后，測定方法的精密度，見表2。結(jié)果可見，黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)在2.30～3.48之間，表明本方法的精密度良好。

表2 方法的精密度(n=6)

3.3.4 方法回收率實(shí)驗(yàn)

將植物油精確稱取后，分別加入一定量的黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2，混合制成高中低3個(gè)不同量的加標(biāo)樣品，每個(gè)加標(biāo)量取6個(gè)平行樣品，按樣品的處理方法提取后，應(yīng)用高效液相色譜色譜儀分析，測得平均回收率，見表3.結(jié)果可見；黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2，方法回收率在94.0%～105.7%之間，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

4 結(jié)論

本研究建立了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測植物油中黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2，的分析方法，并對方法的準(zhǔn)確性及精密度進(jìn)行了驗(yàn)證。研究表明，經(jīng)免疫親和柱凈化，能夠快速、特異地將黃曲霉毒素從樣品中分離出來，凈化程序簡單、凈化率高，適合于復(fù)雜基質(zhì)中黃曲霉毒素的檢測。該方法用于植物油中黃曲霉毒素B1,B2,G1，G2，的檢測，靈敏準(zhǔn)確、重復(fù)性好、特異性高、簡便快速、應(yīng)用范圍廣，滿足植物油B1,B2,G1，G2，安全的檢測要求。

5 建議

由于黃曲霉毒素是高致癌物質(zhì)，接觸過黃曲霉毒素的物品需置于6%次氯酸鈉消毒液中浸泡至少30min，然后用洗滌液、自來水、三蒸水依次洗滌。

[1] 杭州大學(xué)分析化學(xué)教研室. 分析化學(xué)手冊 第二分冊[M] .北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 1997： 608 -631.

[2] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SNT 3868-2014 出口植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測-免疫親和柱凈化高效液相色譜法[S].北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

(本文文獻(xiàn)格式：賴宣丞，廖長儒，曾德斌.免疫親和柱凈化-HPLC法測定植物油中黃曲霉毒素[J].山東化工，2017，46(14)：80-81，85.)

Detecting of Aflatoxin B1,B2,G1,G2in VegetableOil by HPLC with Immunoaffinity Columns

LaiXuancheng,LiaoChangru,ZengDebin

(Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Laboratory of Physical and Chemical Test,Hainan 570203,China)

Objective A method for the detecting of aflatoxin B1,B2,G1,G2in vegetable oil by HPLC with immunoaffinity columns was established. Methods Samples were extracted with methanol -ater(55+45)solution. After oscillated and centrifugated,he lower layer of extraction was filtered,iluted with water and filtered. The filtrate was then passed through immunoaffinity column,hen determined by fluorescence detector with large volume flow cell. Results Under optimum conditions,he limits of detection of aflatoxin B1,G1were 0.067μg / kg,he limits of detection of aflatoxin B2, G1were 0.02μg / kg,Respectively and the recoveries of aflatoxin were 94.0%～105.7%.The method is simple,apid and accurate,and is applicable for the determination of aflatoxins in vegetable oil.

aflatoxin B1,B2,G1,G2; large volume flow cell.; vegetable oil

2017-05-11

賴宣丞(1987—)，女(黎族)，海南萬寧人，助理工程師，本科學(xué)士學(xué)位，主要從事食品檢測工作。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)14-0080-02