李曉川+周平+王朝海

摘要：利用BLASTp程序在馬鈴薯全基因組中共鑒定出54個(gè)潛在的馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子，分別屬于7個(gè)糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，分析這54個(gè)馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在不同組織器官、發(fā)育階段、生物及非生物脅迫以及激素刺激下的表達(dá)水平與特性。該結(jié)果有助于加深對(duì)馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的了解，可為發(fā)現(xiàn)能提高馬鈴薯經(jīng)濟(jì)性的新基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；糖轉(zhuǎn)運(yùn)子；基因組；系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S532.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0024-03

在植物中，碳水化合物被當(dāng)作普遍的能量流通媒介，在整體水平上糖類的運(yùn)輸被輸導(dǎo)組織所控制，因此有了同化及儲(chǔ)藏組織的概念[1]。典型的同化組織是光合作用活躍的組織，而儲(chǔ)藏組織如果實(shí)、塊莖等需要從同化組織轉(zhuǎn)運(yùn)光合作用產(chǎn)物才能發(fā)育。在大多數(shù)植物種類中首選蔗糖作為在韌皮部篩管中長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)奶妓衔颷2]。在細(xì)胞內(nèi)，糖類同樣在各細(xì)胞器之間運(yùn)輸，而液泡則充當(dāng)了許多種碳水化合物的儲(chǔ)藏器官[3]。從細(xì)胞膜或液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖，無(wú)論是主動(dòng)運(yùn)輸還是被動(dòng)擴(kuò)散，都需要受到糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的介導(dǎo)才得以維持在一個(gè)較高的速率上。

盡管蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（sucrose transporter，SUC或SUT）在馬鈴薯中僅含有3個(gè)成員（在擬南芥中有9個(gè)成員），但是單糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在擬南芥中共有53個(gè)成員[4]，它們被劃分成7個(gè)基因家族[5]，目前通常認(rèn)為這7個(gè)基因家族分別為糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sugar transporter protein，STP）家族、糖促進(jìn)蛋白（sugar facilitator protein，SFP）家族、多元醇/單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（polyol/monosaccharide transporter，PMT）家族、肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（inositol transporter，INT）家族、質(zhì)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（plastidic glucose translocator，pGlcT）家族、液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（tonoplast monosaccharide transporter，TMT）家族、液泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vacuolar glucose transporter，VGT）家族。盡管一些基因家族（如SUC、STP）有非常全面的基因功能分析數(shù)據(jù)（如轉(zhuǎn)運(yùn)活力、表達(dá)水平、亞細(xì)胞定位以及轉(zhuǎn)基因分析），但是對(duì)許多小基因家族的成員表征分析的報(bào)道非常少，尤其是在一些非模式物種中。

馬鈴薯是全球第四大作物，同時(shí)也是糧菜兼用型作物，對(duì)馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在全基因組水平上的調(diào)查有利于提高對(duì)它的理解，從而有助于鑒定提高馬鈴薯經(jīng)濟(jì)性的新基因。根據(jù)馬鈴薯參考基因組[6]確定54個(gè)編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因座，使用系統(tǒng)進(jìn)化分析的方法，將所有糖轉(zhuǎn)運(yùn)子劃分到已知的家族內(nèi)，在每個(gè)家族內(nèi)，將馬鈴薯與其他植物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)比進(jìn)化關(guān)系。利用RNA轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)，分析糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在不同組織器官、發(fā)育階段、生物及非生物脅迫以及激素刺激下的表達(dá)水平。通過(guò)全面分析馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族，為馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的鑒定

馬鈴薯潛在的糖轉(zhuǎn)運(yùn)子，使用http：//www.solgenomics.net上的BLASTp工具，以每個(gè)家族中在擬南芥及番茄中已鑒定的成員的蛋白序列作為查詢序列，從馬鈴薯參考基因組[6]中鑒定出來(lái)。

1.2預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域

應(yīng)用WoLF PSORT程序預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的亞細(xì)胞定位（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp）[7]。應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域[8]。

1.3糖轉(zhuǎn)運(yùn)子RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析

利用馬鈴薯基因組測(cè)序協(xié)會(huì)（potato genome sequencing consortium，PGSC）的Illumina RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)模式[7]。數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)豐度用每百萬(wàn)個(gè)映射上的片段數(shù)中映射到外顯子中的每1 000個(gè)堿基上的片段個(gè)數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，F(xiàn)PKM）值表示。對(duì)組織器官及發(fā)育時(shí)期的熱圖（heat map）進(jìn)行構(gòu)建，F(xiàn)PKM值首先經(jīng)過(guò)以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)于非生物脅迫及生物脅迫以及激素處理的熱圖進(jìn)行構(gòu)建時(shí)，首先計(jì)算與相應(yīng)的對(duì)照的對(duì)比值。熱圖使用MeV 4.9.0軟件進(jìn)行構(gòu)建[9]。

2結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子成員及其同源蛋白的進(jìn)化分析

應(yīng)用已鑒定的糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的氨基酸序列，通過(guò)BLASTp程序檢索馬鈴薯參考基因組，鑒定出54個(gè)編碼全長(zhǎng)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因座，結(jié)果如圖1所示，通過(guò)進(jìn)化分析將它們分成8個(gè)基因家族（蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族、糖轉(zhuǎn)運(yùn)子家族、糖促進(jìn)蛋白家族、多元醇/單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、質(zhì)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、液泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族）。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)氨基酸數(shù)目并應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子擁有8個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)域以及400個(gè)以上的氨基酸。糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，多數(shù)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子定位在細(xì)胞膜及液泡膜上，此外，少數(shù)幾個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子預(yù)測(cè)定位在葉綠體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

在馬鈴薯中，3條氨基酸序列經(jīng)鑒定屬于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族。蛋白質(zhì)分別形成11個(gè)或12個(gè)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域（TMD）。這與早期識(shí)別的3個(gè)馬鈴薯蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]一致，而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)更多的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。

糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（STP）在水稻中也被稱為單糖轉(zhuǎn)運(yùn)子家族（monosaccharide transporter，MST），在葡萄中被稱為己糖轉(zhuǎn)運(yùn)子家族（hexose transporter，HT），是馬鈴薯中糖轉(zhuǎn)運(yùn)子最大的家族，有20個(gè)成員（圖1），蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞膜或液泡膜中。在馬鈴薯基因組中，10個(gè)氨基酸序列經(jīng)鑒定屬于糖促進(jìn)蛋白家族（SFP），也被稱為類脫水初反應(yīng)6家族（early response to dehydration 6-like，ERD 6-like），蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞膜或液泡膜中。9個(gè)基因編碼多元醇/單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PMT或PLT）（圖1），PMT的一般底物是糖醇如山梨糖醇或甘露糖醇，它在一些物種中取代蔗糖作為光合作用同化物的長(zhǎng)距離運(yùn)輸形式，最著名的是果樹(shù)薔薇科[11]。在馬鈴薯基因組中，鑒定出3個(gè)潛在的編碼H+/Na+MYO-肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（INT或IRT）的基因座，預(yù)測(cè)含有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，含有496～578個(gè)氨基酸分子（圖1），INT被認(rèn)為參與H+和肌醇的協(xié)同運(yùn)輸。4個(gè)編碼質(zhì)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（pGlcT）的基因座在馬鈴薯基因組中找到，預(yù)測(cè)形成9個(gè)或10個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域，蛋白在亞細(xì)胞水平預(yù)測(cè)定位在葉綠體（StpGlcT1和StpGlcT2）或細(xì)胞膜（StpGlcT3和StpGlcT4）中（圖1）。在馬鈴薯基因組中檢測(cè)到3種液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TMT），TMT在大多數(shù)物種中是氨基酸數(shù)量大于700的大蛋白，擁有10～11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1）。液泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（VGT）是糖轉(zhuǎn)運(yùn)子中成員最少的家族。在馬鈴薯基因組中鑒定出2個(gè)成員，分別是由503（StVGT1）、545（StVGT2）個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞膜和葉綠體中（圖1）。endprint

2.2糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)

為確定糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的組織特異性以及發(fā)育時(shí)期表達(dá)，利用PGSC在馬鈴薯不同器官和發(fā)育階段以及在非生物脅迫處理、生物脅迫處理和激素刺激時(shí)的不同轉(zhuǎn)錄組經(jīng)mRNA測(cè)序所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6，12]，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)隨后的RNA定量分析驗(yàn)證顯示出很高的準(zhǔn)確性[12-13]。

PGSC的馬鈴薯RNA-seq提供了在16種組織中超過(guò) 22 000 個(gè)馬鈴薯基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，代表了主要器官和發(fā)育階段。54個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因，其中44個(gè)在16個(gè)不同的發(fā)育階段和器官檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)，而其余10個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因可能由于翻譯水平太低而無(wú)法檢測(cè)到，或者因?yàn)榫哂锌臻g和時(shí)間表達(dá)特性而不包括在這個(gè)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中。在這44個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因中有21個(gè)在所有的16種組織中都有表達(dá)，7個(gè)在1～5種組織中表達(dá)，4個(gè)在6～10種組織中表達(dá)，12個(gè)在11～15種組織中表達(dá)。一些糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因表現(xiàn)出表達(dá)的組織特異性，如StSTP4、StSTP10、StSTP12、StPMT8、StINT3、StSFP7 均在花器官尤其是雄蕊中有表達(dá)。StSTP1、StSTP5在葉子和匍匐莖中表達(dá)量較高，StSTP1的同源蛋白（SlSTP1、AtSTP1、VvHT1）有己糖的運(yùn)輸活性。與AtPMT1、AtPMT2序列相近的StPMT4，在所有16種組織中都有較高的表達(dá)，而AtPMT1、AtPMT2被證明參與轉(zhuǎn)運(yùn)木糖醇和果糖[10]。StpGlcT1在成熟的果實(shí)中有高水平的表達(dá)，可能與它的同源蛋白一樣參與到成熟果實(shí)中通過(guò)分解淀粉而得到的葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。

利用在非生物脅迫處理及生物脅迫處理時(shí)得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因進(jìn)行表達(dá)譜分析。非生物脅迫處理（處理整株植物24 h）包括鹽（150 mmol/L NaCl）、甘露糖醇（260 mmol/L）、熱脅迫（35 ℃）等，參加分析的數(shù)據(jù)為計(jì)算每個(gè)處理相對(duì)于對(duì)照的相對(duì)表達(dá)豐度。在非生物脅迫處理下，30個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在1個(gè)或1個(gè)以上脅迫條件下被誘導(dǎo)正表達(dá)，其中11個(gè)基因在所有的3種條件下在一定程度上均被正誘導(dǎo)，15個(gè)基因在2種條件下在一定程度上均被正誘導(dǎo)，4個(gè)基因在1種條件下在一定程度上均被正誘導(dǎo)。而StTMT家族在這3種條件下表達(dá)水平均沒(méi)有提升，而StSFP家族在鹽脅迫下有8個(gè)成員表達(dá)均有提高，StSFP6在熱脅迫下表達(dá)提高了10倍。StINT2在鹽和甘露糖醇脅迫下、StVGT2在鹽和熱脅迫下表達(dá)水平均有較大的提高。

生物脅迫處理包括接種馬鈴薯晚疫病菌和2種化學(xué)誘導(dǎo)因子[苯并噻二唑（BTH，100 mg/mL）、DL-氨基丁酸（BABA，2 mg/mL）]，以及利用離體受傷葉片模仿生物取食。參加分析的數(shù)據(jù)為計(jì)算每個(gè)處理相對(duì)于對(duì)照的相對(duì)表達(dá)豐度。在生物脅迫處理下，30個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子分子在1個(gè)或1個(gè)以上脅迫條件下被誘導(dǎo)正表達(dá)，其中2個(gè)基因（StVGT1和StTMT1）在所有的4種條件下在一定程度上都被正誘導(dǎo)；StVGT1和StTMT1在2種化學(xué)誘導(dǎo)因子下表達(dá)水平有較大提高。StSTP5、StPMT7、StpGlcT4、StVGT2等4個(gè)基因在受傷葉片上表達(dá)水平有較大的提高，其中StSTP5可能與參與生物脅迫時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物的VvHT5為同源蛋白。

為了鑒定激素應(yīng)激糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因，利用激素刺激時(shí)得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析整株植物經(jīng)IAA（吲哚乙酸）10 mmol/L、6-BA （6-芐基腺嘌呤）10 mmol/L、GA3（赤霉酸）50 mmol/L、ABA（脫落酸）50 mmol/L處理24 h后的相對(duì)表達(dá)豐度。在激素刺激下，22個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在1個(gè)或1個(gè)以上脅迫條件下被誘導(dǎo)正表達(dá)，其中5個(gè)基因（StPMT2、StPMT6、StSFP1、StSFP2、StVGT2）發(fā)現(xiàn)在所有的4種條件下在一定程度上都被正誘導(dǎo)，StVGT2在6-BA處理后表達(dá)量提高11.8倍。

3結(jié)論

本研究在全基因組水平上全面分析了馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族，根據(jù)馬鈴薯參考基因組確定54個(gè)編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因，通過(guò)比較基因組學(xué)利用不同物種的同源糖轉(zhuǎn)運(yùn)子了解馬鈴薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能，對(duì)比54個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因中的44個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在16種主要器官和發(fā)育階段的組織中的表達(dá)情況，為下一步分析糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的具體功能提供理論基礎(chǔ)。

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