陳旭玉，楊云，劉洋洋，馮劍，劉培衛(wèi)，魏建和*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點研究室)，海南 ?？?570311)

·專題·

擬層孔菌(Fomitopsis sp.)促進沉香的形成及其生物學特性△

陳旭玉1，2，楊云1，2，劉洋洋1，2，馮劍2，劉培衛(wèi)2，魏建和1，2*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點研究室)，海南 海口 570311)

目的：為了獲得促進白木香(Aquilariasinensis)形成沉香的真菌及其生物學特性。方法：采用PDA培養(yǎng)基分離并純化真菌及菌液接種到白木香樹進行功能驗證。形態(tài)學特征結(jié)合ITS序列進行真菌鑒定和平板培養(yǎng)法測定真菌生物學特性。結(jié)果：分離到1株真菌 ASAF01，其菌液輸?shù)桨啄鞠?個月后能促進沉香的形成。ASAF01鑒定為擬層孔菌(Fomitopsissp.)，屬于擬層孔菌屬(Fomitopsis)，擬層孔菌科(Fomitopsidaceae)，多孔菌目(Polyporales)，傘菌綱(Agaricomycetes)，擔子菌門(Basidiomycota)，其菌最適在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上生長，最適溫度是35 ℃，最適pH值為7，最適碳源和氮源為可溶性淀粉和酵母浸膏。結(jié)論：擬層孔菌(Fomitopsissp.)ASAF01能促進白木香結(jié)香。

白木香；真菌促進結(jié)香；鑒定；擬層孔菌(Fomitopsissp.)

白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是國家二級重點保護野生植物，是珍貴國產(chǎn)藥材沉香的唯一植物資源。沉香具行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘之功效[1]。沉香的形成非常特殊，健康的白木香不能產(chǎn)生沉香類物質(zhì)，只有受到物理傷害、化學傷害及真菌侵染等外界的傷害后才誘導結(jié)香。由于沉香形成的特殊性，致使沉香的結(jié)香技術(shù)廣泛被關注。

沉香的結(jié)香技術(shù)有物理結(jié)香(刀砍，火烙等)，化學結(jié)香(乙酸，甲酸等)和微生物結(jié)香(色二孢，黃綠墨爾菌)等。國內(nèi)外已報道微生物促進結(jié)香，1952年，Bhattacharya提出白木香結(jié)香與真菌感染有關[2]。1976年，廣東省植物研究所發(fā)現(xiàn)沉香的形成與植物感染真菌有關，如黃綠墨耳菌感染白木香木材傷口后能加速沉香物質(zhì)(倍半萜類化合物和色酮類化合物)形成[3，4]。1977年，Gibson分離一株內(nèi)生真菌(CytosphaeramangiferaeDied)能使健康的白木香結(jié)香[5]。2003年，Tabata等利用5種鐮刀菌進行人工誘導產(chǎn)生沉香[6]。馮乃憲從白木香中篩選出蒂腐色二孢(Botryosphaeriarhodina)紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)和2株木霉并證實能促進沉香形成[7]。陳旭玉分離一株擬盤多毛孢(Pestalotiopsisvirgatula) 6個月后能促進沉香的形成[8]。許多科研工作者已經(jīng)證實真菌可以促進結(jié)香，本文研究的目的是篩選出促進結(jié)香的優(yōu)質(zhì)真菌，為應用真菌結(jié)香和利用真菌促進高品質(zhì)沉香奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料

真菌從海南省萬寧市南藥園采取砍傷3年的沉香樣品中分離，樣品經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所植物資源研究室朱平教授鑒定。

1.2方法

1.2.1儀器和方法 WT3003千分之一電子天平秤 (賽多利斯科學儀器(北京有限公司)；JY02S紫外分析儀型號 (北京君意東方電泳設備有限公司)；Mill—QAdvantageA10超濾水凈機 (北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；SB25—12DTDN型超聲波清洗機(寧波新蘭生物科技股份有限公司)。

試劑主要有沉香對照藥材(批號121222-201102)購自中國食品藥品檢定研究院，其余為分析純。

1.2.2白木香結(jié)香真菌 ASAF01的鑒定 挑取菌絲ASAF01接種到PDA液體培養(yǎng)基中，室溫28℃、150r·min-1振蕩培養(yǎng)3～15d，收集菌絲，過濾并干燥，用液氮研磨成細粉，利用植物基因組試劑盒(天根生化科技有限公司) 提取總DNA。以ITS1(5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′) 為引物進行 PCR擴增。擴增體系為：DNA buffer1μL；Master Mix (北京天根公司)12.5μL；引物(10mol·L-1) 各1μL；滅菌dd H2O9.5μL，共25μL。反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將獲得的序列與 Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較[9]。

1.2.3薄層鑒定 將擬層孔菌(Fomitopsissp.)接種于白木香樹干6個月后，離輸液口5cm處砍下，剖香，然后進行薄層分析，具體方法為：取沉香樣品粉末1g置于具塞三角瓶中，加甲醇25mL，超聲處理60min，濾液定容至25mL，作為供試品溶液。另取沉香對照藥材1g，同法制成沉香對照藥材溶液。取6，7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮加甲醇制成每毫升含0.05mg的對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(10∶1)為展開劑，展開2次，取出晾干，置紫外燈光(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點[8]。

1.2.4不同培養(yǎng)基對擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲生長的影響 選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、察氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)共5種培養(yǎng)基，接種直徑為5mm菌塊至培養(yǎng)皿中心，30℃恒溫箱中培養(yǎng)，3d和5d后采取十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.2.5不同溫度對擬層孔菌(Fomitopsis sp.)菌絲生長的影響 取5mm菌塊置于PDA平板中心，然后分別放在15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃和45℃恒溫培養(yǎng)。3d和5d后采取十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.2.6不同pH值對擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲生長的影響 用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基，制成pH值分別為5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，滅菌后重新調(diào)pH值，將5mm菌塊于不同 pH值的 PDA 平板中心上，30℃恒溫箱中培養(yǎng)，3d和5d后采取十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復[10]。

1.2.7不同碳源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)絲生長的影響 采用察氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的蔗糖以甘露醇、D-山梨醇、乳糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖等不同的碳源等量代替制成平板，將5mm菌塊置于平板中央，30℃下培養(yǎng)3d和5d后采取十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.2.8不同氮源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲生長的影響 采用察氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的硝酸鈉以牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、等不同的氮源等量代替制成平板，將5mm菌塊置于平板中央，30℃下培養(yǎng)3d和5d后采取十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

2 結(jié)果

2.1結(jié)香真菌的分離和鑒定

ASAF01在PDA培養(yǎng)基上的菌落為白色，勻質(zhì)狀，邊緣整齊；菌絲纖細，有叉狀分枝，不易產(chǎn)孢。ASAF01測序獲得的基因序列長度為656bp(見圖1)，將獲得的序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進行 Blast 比對，結(jié)果顯示其序列與Fomitopsismeliae(AccessionNo.HQ248221)同源性達97%，與Fomitopsiscf.meliae(AB540581；GQ982889；FJ372675和FJ372673.1)同源性達96%。通過形態(tài)特征和分子特征將其鑒定為擬層孔菌(Fomitopsissp.)，現(xiàn)已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC NO.7802。

注：A.ASAF01真菌的菌落；B.擬層孔菌(Fomitopsis sp.)菌絲形態(tài)；C.ASAF01 菌株的 PCR 產(chǎn)物圖1 ASAF01真菌的鑒定

2.2結(jié)香真菌的結(jié)香功能驗證及薄層鑒定

擬層孔菌(Fomitopsissp.)接種6個月后即可促進白木香結(jié)香且形成的沉香中間不易腐爛(見圖2)。

圖2 擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01 菌株促進沉香的形成

注：BK為健康的白木香；ST為色酮對照；CK為中國藥典規(guī)定的對照藥材；IW為ASAF01菌株接種6個月的沉香；EA為優(yōu)等的野生沉香圖3 擬層孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01誘導形成沉香的薄層鑒定

經(jīng)薄層鑒定后，擬層孔菌(Fomitopsissp.)接種6個月后獲得的沉香與野生沉香和對照藥材獲得相似斑點(見圖3)，說明該菌株能促進沉香的形成。

2.3結(jié)香真菌的生物學特性

2.3.1不同培養(yǎng)基對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生長的影響 擬層孔菌(Fomitopsissp.)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上生長速度最快，而在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMV)上生長最慢(見圖4)。

圖4 擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在不同培養(yǎng)基上生長的結(jié)果

2.3.2不同溫度對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生長的影響 擬層孔菌(Fomitopsissp.)在15～40℃范圍內(nèi)均能生長，最適溫度為35℃，45℃菌絲生長緩慢(見圖5)。

圖5 擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在不同溫度上生長的結(jié)果

2.3.3不同pH值對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生長的影響 擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在pH5～11范圍內(nèi)均能生長，最適pH值7(見圖6)。

圖6 擬層孔菌(Fomitopsis sp.)菌絲在不同pH值上生長的結(jié)果

2.3.4不同碳源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生長的影響 不同碳源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲生長影響不大，最適碳源是可溶性淀粉(見圖7)。

圖7 擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在不同碳源上生長的結(jié)果

2.3.5不同氮源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生長的影響 不同氮源對擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲生長影響不大，最適氮源為酵母浸膏(見圖8)。

圖8 擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在不同氮源上生長的結(jié)果

3 討論

通過對擬層孔菌(Fomitopsissp.)生物學特性研究結(jié)果表明，擬層孔菌(Fomitopsissp.)在溫度15～35℃都能生長，35℃是菌絲生長最適溫度，說明該菌生長的條件符合在熱帶地區(qū)結(jié)香。擬層孔菌(Fomitopsissp.)菌絲在pH5～11的固體培養(yǎng)基能生長，在PH2-11的液體培養(yǎng)基上也能生長，說明該菌對環(huán)境的耐受力很強。

2010年，本課題組提出“白木香防御反應結(jié)香假說”[11]：即傷害或真菌侵染均是作為激發(fā)子誘導白木香產(chǎn)生防御反應，產(chǎn)生具有抑菌活性的防御物質(zhì) (藥材沉香的主要化學成分)，這些防御物質(zhì)與細胞其他組分復合形成的侵填體堵塞了次生木質(zhì)部的導管和維管束，以抵御外界物理、化學傷害或真菌侵染對白木香的進一步損傷。作者從白木香樹分離了1株擬層孔菌(Fomitopsissp.)并證實能促進沉香的形成。擬層孔菌(Fomitopsissp.)也是一種腐木菌[12]，該菌是64種腐朽菌中降解木材最高的一種[13]。在林木和農(nóng)作物上常引起褐腐病[14，15]。另外，擬層孔菌(Fomitopsissp.)能產(chǎn)生纖維素酶[16，17]，具有降解纖維素的作用。根據(jù)假說可以推測沉香的形成可能是擬層孔菌(Fomitopsissp.)產(chǎn)生纖維素酶降解植物纖維誘導白木香防御反應形成沉香，但其機制有待于研究。

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EffectofFomitopsissp.onpromotingAgarwoodFormationandItsBiologicalCharacteristics

CHEN Xuyu1，2，YANG Yun1，2，LIU Yangyang1，2，F(xiàn)ENG Jian2，LIU Peiwei2，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;2. Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Hainan Branch Institute of Medicinal Plant, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Haikou 570311, China)

Objective：In order to screen a fungi to promote the agarwood formation inAquilariasinensis.Methods：The fungi were isolated by PDA medium，and then inoculated toA.sinensisto verify whether the fungi could promote agarwood formation.The fungi were identified based on morphological characteristics and DNA sequences analysis，then the biological characteristics observed by flat method.Results：ASAF01 strain could promote agarwood formation and was identified asFomitopsissp.，belonging toFomitopsis，F(xiàn)omitopsidaceae，Polyporale，Agaricomycetes，Basidiomycota.The results of biological characteristics showed that the mycelia ofFomitopsissp.grew fastest in the PDA medium.The optimum temperature for the mycelial growth was 35 ℃ and the optimum pH value was 7.The optimal carbon sources and carbon source were soluble starch and yeast extract.Conclusion：Fomitopsissp.ASAF01 can promote agarwood formation.

Aquilariasinensis；fungi promote agarwood formation；identification；Fomitopsissp.

國家自然科學資金(81303312)項目資助；海南省應用技術(shù)研發(fā)及示范推廣專項(ZDXM2015059)項目資助；海南省重大科技計劃項目(ZDKJ2016004)；中組部“萬人計劃”(99950534)

] 魏建和，教授，研究方向：藥用植物基因資源與分子育種；Tel：(0898)31589009，E-mail：wjianh@263.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.009

2017-01-08)

*[