洪毅，高莉，姜作玲

(上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266000)

·中藥工業(yè)·

養(yǎng)心氏滴丸純化工藝研究

洪毅*，高莉，姜作玲

(上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266000)

目的：研究養(yǎng)心氏滴丸的純化工藝。方法：采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，采用HPLC法測定葛根素的含量，采用大孔樹脂吸附的方法對養(yǎng)心氏滴丸水提液進(jìn)行純化。結(jié)果：確定了養(yǎng)心氏滴丸的純化工藝，即采用JD-1(WLD)型大孔吸附樹脂，樹脂用量與藥材量的比例為1.5∶1，吸附流速為0.1 L·min-1·kg-1，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為樹脂用量的3倍。結(jié)論：確定了養(yǎng)心氏滴丸純化工藝的可行性，獲得了純化工藝參數(shù)，為大規(guī)模生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

養(yǎng)心氏滴丸；黃芪甲苷；葛根素；大孔吸附樹脂

養(yǎng)心氏滴丸處方由黃芪、葛根、丹參、黨參、淫羊藿、山楂、靈芝、地黃、當(dāng)歸、黃連、延胡索、人參、甘草十三味中藥材組成，處方量共890 g。具有益氣活血、化瘀止痛的功能，用于治療冠心病、心絞痛。方中君藥為黃芪，臣藥為葛根，黃芪甲苷和葛根素分別為黃芪和葛根的主要有效成分之一?，F(xiàn)代研究表明，黃芪甲苷和葛根素對心血管系統(tǒng)疾病具有明顯的藥理活性，其中黃芪甲苷具有改善心肌重構(gòu)、改善心肌能量代謝、保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、抑制氧自由基產(chǎn)生等作用[1]；葛根素具有增加心肌血流量、改善心肌供氧、降低血小板聚集及血液黏度、改善失常心律等作用[2]。

在前期研究中，我們針對君藥的指標(biāo)成分建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定黃芪甲苷含量[3]，針對臣藥指標(biāo)成分建立HPLC法測定葛根素含量。同時(shí)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以黃芪甲苷總量、葛根素總量和干膏率為考察指標(biāo)，進(jìn)行了養(yǎng)心氏滴丸提取工藝的研究[4]，確定了養(yǎng)心氏滴丸的最佳提取工藝。本次研究主要以大孔吸附樹脂對養(yǎng)心氏滴丸水提液進(jìn)行純化，考察相關(guān)純化工藝的相關(guān)參數(shù)，確定養(yǎng)心氏滴丸的純化工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AT201電子天平(梅特勒)；Agilent 1200型高效液相色譜；Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器。

1.2 試藥

養(yǎng)心氏滴丸處方所需中藥購自青島國風(fēng)大藥房，符合《中華人民共和國藥典》2010版相關(guān)要求。

JD-1(WLD)型大孔吸附樹脂(青島騰祥)；黃芪甲苷對照品、葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110882-200714，110580-201005)；乙睛、甲醇(德國默克，色譜純)色譜用水為雙蒸水；提取用水為自制純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的HPLC-ELSD含量測定方法

方法學(xué)考察見參考文獻(xiàn)[3]。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(32∶68)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；ELSD檢測器漂移管溫度為105 ℃，氣體(空氣)流速為2.7 mL·min-1；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜圖見圖1。

注：A.黃芪甲苷對照品;B.樣品中黃芪甲苷。圖1 黃芪甲苷的HPLC圖

2.2 葛根素的HPLC含量測定方法

方法學(xué)考察參見文獻(xiàn)[4]。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為250 nm。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜圖見圖2。

注：A.黃芪甲苷對照品;B.樣品中黃芪甲苷。圖1 黃芪甲苷的HPLC圖

2.3 養(yǎng)心氏滴丸提取工藝

根據(jù)前期研究結(jié)果[4]確定養(yǎng)心氏滴丸水煎煮條件：加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。

2.4 養(yǎng)心氏滴丸純化工藝條件

大孔吸附樹脂是一種人工合成的比表面積很大的高分子吸附劑，能在中藥水提液中選擇性吸附各種類型的有效成分，如生物堿、黃酮、苷類、蒽醌等，從而達(dá)到分離、純化中藥水提液有效部分，縮小中藥劑量，提高藥品質(zhì)量的目的[5]。

2.4.1 樹脂型號選擇 根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇D101型、JD-1(WLD)型和HP20型樹脂，主要根據(jù)最大上柱量確定最佳樹脂型號。

稱取處方量1/2的藥材，按工藝要求煎煮3次，合并濾液，上柱液備用；分別將上述3種樹脂裝入6根玻璃柱(φ=10)，分別依次加入上柱液10、20、40、60、80、100 mL，靜置30 min，放出過柱液，控制流速1～2 mL·min-1，收集過柱液。以黃芪甲苷和葛根素為目標(biāo)成分，采用薄層色譜法跟蹤目標(biāo)成分的流出情況，結(jié)果如表1。

由表1可知，上述3種大孔吸附樹脂對上柱液中目標(biāo)成分均具有較好的吸附能力，吸附力大小依次為黃芪甲苷>葛根素。薄層色譜表明，葛根素均能被上述3種樹脂最先檢測出來，吸附力較弱，可采用薄層色譜法檢測過柱液中有無葛根素，以此作為估測樹脂最大上柱量和篩選最佳樹脂型號的簡捷方法。以葛根素為指標(biāo)，最大上柱量大小排序：HP20>JD-1(WLD)>D101。

表1 3種樹脂最大上柱量的定性檢測結(jié)果

注：+為可見；±為隱約可見；-為未見。下同。

HP20樹脂為進(jìn)口樹脂，吸附能力最大，但價(jià)格過于昂貴，用于實(shí)際生產(chǎn)成本過高；JD-1(WLD)樹脂和D101樹脂對黃芪甲苷和葛根素吸附均較好，D101稍差。從樹脂柱最大上柱量、樹脂安全性、樹脂成本、預(yù)處理等方面綜合考慮，本品選用JD-1(WLD)大孔吸附樹脂分離純化。

2.4.2 樹脂飽和吸附率的測定 稱取處方量1/2的藥材，按工藝要求煎煮3次，濾過，合并濾液。濾液通過已處理好的內(nèi)裝20 g吸附樹脂(濕態(tài))的玻璃柱(φ=10)，吸附完畢，用水洗滌，再用70%乙醇洗脫，洗脫液置水浴上濃縮，稱重，計(jì)算出樹脂飽和吸附量為65 mg·g-1。

2.4.3 吸附樹脂漏析吸附力的測定 按處方比例取藥材48 g，按工藝要求煎煮3次，濾過，合并濾液。濾液通過已處理好的內(nèi)裝10 g吸附樹脂(濕態(tài))的玻璃柱(φ=10)，控制流速為1 mL·min-1，至流出液用試管反應(yīng)檢測剛好黃酮反應(yīng)呈陽性時(shí)停止吸附，用水洗滌，再用70%乙醇洗脫，洗脫液置水浴上蒸干，稱重，計(jì)算出樹脂漏析吸附量為30 mg·g-1。

2.4.4 吸附流速的研究 按處方稱取藥材89 g，按工藝要求煎煮3次，合并濾液，并將濾液分為4等份，分別通過4根吸附柱(Φ=20，每根柱子均裝50 g樹脂)，控制流速分別為2、4、8、16 mL·min-1，并用鹽酸鎂粉反應(yīng)檢查廢液中有無黃酮，結(jié)果如表2。

從表2看出，吸附流速需控制，才能保證吸附完全。按表2推算到工業(yè)生產(chǎn)，用Φ=360的吸附柱，內(nèi)裝100 kg樹脂，10～20 L·min-1流速進(jìn)行吸附，可保證吸附完全。

表2 吸附流速對吸附效果的影響

注：

2.4.5 樹脂與藥材比例關(guān)系的研究 按處方比例稱取藥材543 g，按工藝要求煎煮3次，濾過，合并濾液，并將濾液分為6等份(每份相當(dāng)于89 g藥材，即1/10處方量)，分別通過6根吸附柱(Φ=40，每根柱子分別裝44.5、89、133.5、178、222.5、267 g樹脂)，然后用5倍藥材量的70%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮、干燥。見表3、圖3。

表3 樹脂與藥材比例關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 樹脂與藥材用量關(guān)系圖

從上表看出，藥材提取率及葛根素量隨樹脂用量增加而增加，但從生產(chǎn)實(shí)際考慮，一般選擇藥材量的1.5倍的樹脂就能滿足生產(chǎn)的要求，樹脂用量過大，收率增加不多，而洗脫劑用量大增，在生產(chǎn)上是不經(jīng)濟(jì)的。

2.4.6 洗脫劑(乙醇)濃度的研究 稱取藥材89 g，按工藝要求煎煮3次，合并濾液，并將濾液分為3等份，分別通過3根吸附柱(Φ=20，每根柱子均裝藥材2倍量樹脂)，然后分別用5倍藥材量的50%、70%及90%乙醇洗脫，將洗脫液濃縮、干燥并測定其葛根素含量，結(jié)果見表4。

表4 洗脫劑濃度的比較

結(jié)果70%、90%乙醇的洗脫效果優(yōu)于50%乙醇，70%與90%乙醇洗脫效果無差異，但大生產(chǎn)回收乙醇濃度均為70%左右，便于反復(fù)使用，故洗脫劑濃度選擇70%乙醇。

2.4.7 洗脫劑(70%乙醇)用量的研究 按處方比例稱取藥材飲片50 g，按工藝要求煎煮3次，合并濾液，濾液通過樹脂柱(Ф=20，樹脂用量100 g)，吸附完畢用70%乙醇洗脫，當(dāng)流出液顏色變深時(shí)開始分段收集洗脫液，每份收集1倍樹脂量即100 mL，共收集10份，分別濃縮，干燥。結(jié)果見表5、圖4。

表5 載藥樹脂柱70%乙醇洗脫分段收集表

圖4 乙醇用量洗脫曲線

從表5可知，用70%乙醇作為洗脫劑，用量為吸附樹脂量的3倍，可達(dá)到理想的洗脫效果。

2.4.8 純化工藝技術(shù)參數(shù)小結(jié) 見表6。

表6 純化工藝技術(shù)參數(shù)表

2.5 復(fù)方水提液吸附前后轉(zhuǎn)移率的測定

選擇測定復(fù)方水提液吸附前后黃芪、葛根的轉(zhuǎn)移率，以進(jìn)一步證明該純化方使用的可行性。

按處方稱取處方量1/10藥材，水煎3次，合并3次濾液并等分成2份，其中一份置水浴上濃縮，真空干燥，得復(fù)方水煮液樣品，另一份通過已處理好的樹脂柱(φ=40)，吸附完畢后，用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，置水浴上濃縮，真空干燥，得復(fù)方洗脫液樣品，將上述2個(gè)樣品按制定的黃芪甲苷和葛根素含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表7～8。

表7 復(fù)方水煮液上柱前后黃芪甲苷的含量測定

表8 復(fù)方水煮液上柱前后葛根素的含量測定

結(jié)果表明，養(yǎng)心氏復(fù)方中黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率為90.01%，復(fù)方中葛根的轉(zhuǎn)移率為98.12%，故采用大孔樹脂吸附的養(yǎng)心氏滴丸純化工藝從化學(xué)的角度(有效成分的定性、定量考察)是可行的。

3 討論

養(yǎng)心氏滴丸作為大處方復(fù)方制劑，其水提液中成分復(fù)雜，王治平[6]在對“黃芪-葛根”藥對有效物質(zhì)研究中也顯示，黃芪甲苷與葛根素溶出程度與其所在有效部位其他成分的溶出程度正相關(guān)。因此，采用黃芪甲苷與葛根素作為純化工藝的考察指標(biāo)，操作簡便、準(zhǔn)確性高，在一定程度上反映純化過程中有效部位的富集和轉(zhuǎn)移情況。

通過大孔吸附樹脂進(jìn)行水提液純化，能夠大幅降低干膏量的同時(shí)，保證有效成分90%以上的轉(zhuǎn)移率，從而保證了養(yǎng)心氏滴丸在降低服用量的同時(shí)療效穩(wěn)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定了養(yǎng)心氏滴丸純化工藝技術(shù)參數(shù)，同時(shí)采用黃芪甲苷和葛根素作為考察指標(biāo)，確定了純化工藝的在化學(xué)角度的可行性，為進(jìn)一步滴丸成型提供基礎(chǔ)。為了保證藥品的療效，還需通過藥理藥效方面的進(jìn)一步研究確定工藝的合理性。

[1] 李香華，王洪新.黃芪甲苷在心血管疾病中的作用[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32(1)：132-136.

[2] 徐蘊(yùn).葛根素對心血管疾病治療作用的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(12)：3114-3115.

[3] 黃慶文，向蘭，田紅偉，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定養(yǎng)心氏滴丸中黃芪甲苷含量[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，28(16)：28-29.

[4] 姜作玲，洪毅，趙俊梅，等.養(yǎng)心氏滴丸提取工藝研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10(2)：183-197.

[5] 劉彬果，郭文勇，鐘蕾，等，大孔樹脂吸附技術(shù)在中藥制劑中的應(yīng)用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(6)：452-455.

[6] 王治平.探討“黃芪-葛根”藥對配伍規(guī)律對藥效物質(zhì)的影響[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

PurificationProcessofYangxinshiDrippingPills

HONGYi*，GAOLi，JIANGZuoling

(ShanghaiPharmaceuticalGrouptheQingdaoGrowfulMedicineCo.，Ltd，QingdaoShandong266000，China)

Objective：To study purification process of Yangxinshi Dripping Pills.Methods：Water extract of Yangxinshi Dripping Pills was purified by macroporous resin.Astragaloside IV was determined by HPLC-ELSD.Puerarin was determined by HPLC.Results：The optimal purification condition was determined，that is，macroporous adsorption JD-1(WLD)，the proportion of resin and medicinal materials 1.5∶1，adsorption velocity 0.1 L·min-1·kg-1，eluent of 70% ethanol，three times as many dosage of eluent for the dosage of resin.Conclusion：The optimized purification process has laid the foundation for Yangxinshi Dripping Pills production in large amounts.

Yangxinshi Dripping Pills；astragaloside IV；puerarin；macroporous resin

2016-05-03)

*

洪毅，主管藥師，研究方向：中藥新藥工藝研究及已上市品種二次開發(fā)；Tel:(0532)86058846，E-mail：hongyi2673@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.024