孫婧，戚大偉*，池玉杰，牟洪波

(1.東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

兩種木腐真菌的分離及鑒定

孫婧1，戚大偉1*，池玉杰2，牟洪波1

(1.東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

在影響木材質(zhì)量的眾多因素中，木腐真菌侵染木材造成的木材腐朽現(xiàn)象對木材細胞壁破壞最為嚴重。為了鑒定侵染木材腐朽的病原菌，提高木材質(zhì)量，本文建立一種有效鑒定木腐真菌的分子生物學(xué)方法。以采集木腐真菌子實體為研究對象，通過分離和選擇培養(yǎng)基篩選出目的菌株，并判斷木腐真菌的木材腐朽類型。運用基于PCR技術(shù)的分子生物方法，通過提取基因組DNA，primer5軟件設(shè)計特異性引物對序列擴增，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對木腐真菌進行分子水平的鑒定。并結(jié)合以往研究者運用的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法，對木腐真菌形態(tài)等特征進行觀察。研究結(jié)果表明，木腐真菌S1為紅緣擬層孔菌(Fomitopsispinicola)，木腐真菌S2為木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)。將分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，能夠更加準(zhǔn)確和可靠的對木腐真菌進行鑒定。

木腐真菌；分離純化；分子生物學(xué)鑒定；形態(tài)學(xué)鑒定

E-mail：qidw9806@126.com

0 引言

人類生活和生產(chǎn)中離不開對木材的使用，近年來，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，森林資源出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)象[1]。而在自然界中，木材很容易受到木材腐朽病原菌的侵染，使木材發(fā)生腐朽[2-4]。木腐真菌，即木材腐朽菌，能夠分解木材細胞壁的大型真菌，是導(dǎo)致木材解體和腐朽的重要因素[5-6]。木材腐朽發(fā)生頻率高，分布范圍廣，在適宜環(huán)境條件下，木腐真菌常常侵染林區(qū)的活立木、倒木、枯立木和木材生產(chǎn)使用等場所，降低木材的質(zhì)量，甚至使其失去使用價值，對森林資源的保護和利用造成了巨大的經(jīng)濟損失[7-8]。

為更加合理的使用木材，降低木腐真菌對木材質(zhì)量的影響，有必要對木腐真菌進行鑒定。目前，大多數(shù)采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察法對木腐真菌進行鑒定，但對于形態(tài)極其相似的子實體，有時難以進行區(qū)分。而且不同研究者對同一菌落形態(tài)和菌絲特征描述不同，產(chǎn)生的鑒定結(jié)果可能不同，此時該方法不具備準(zhǔn)確性。本文運用基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)手段，并結(jié)合形態(tài)學(xué)方法，對侵染木材的木腐真菌進行了更加可靠的鑒定[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從小興安嶺涼水自然保護區(qū)白樺林和大興安嶺五營保護區(qū)的紅松林采集木腐真菌子實體，用滅菌的小刀從活立木材樹干部切割，放到無菌袋中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 L，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH自然。

真菌分離培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0[11]。

1.1.3 實驗儀器和主要試劑

儀器：YQH-400F人工氣候培養(yǎng)箱、超凈無菌操作臺、(GR85DA致微)高壓蒸汽滅菌鍋、TechnePrimeQ實時熒光定量PCR儀、紫外可見分光光度計、恒溫震蕩水浴搖床、電子分析天平等。

試劑：生工SK8259 DNA提取試劑盒、愈創(chuàng)木酚、瓊脂糖(巴西)、GoldView、buffer、5×PCR Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木腐真菌的分離與純化

用蒸餾水和棉球?qū)⒆訉嶓w表面擦拭干凈，在無菌操作臺中，用滅菌的鑷子挑取子實體內(nèi)部有活力的組織塊，取4塊接種于真菌分離培養(yǎng)基中，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)。挑取菌落邊緣菌絲，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，涂布平板，反復(fù)劃線純化直至獲得純菌落，接種于斜面培養(yǎng)，存放于4℃冰箱中，保存?zhèn)溆肹12-13]。

菌株復(fù)篩：用0.5 g的愈創(chuàng)木酚溶于30 mL 95%的乙醇中，滴定菌落邊緣，觀察菌落滴定區(qū)域變化。根據(jù)Bavendamm反應(yīng)，產(chǎn)生顯色反應(yīng)說明該菌株具有降解木質(zhì)素的能力，即產(chǎn)生顯色圈的菌株為木材白腐菌，由此可以判斷木材腐朽菌的木材腐朽類型[14]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察法

野外采集木腐真菌的子實體，對其外部形態(tài)進行拍照觀察，并制作臨時載玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)和菌絲特征[15-16]。

1.2.3 菌種基因組DNA提取與PCR體系的建立

采用上海生工SK8259 DNA試劑盒提取基因組DNA，以ITS1和ITS4為通用引物擴增DNA序列[16-18]。

PCR反應(yīng)體系(25 uL)：基因組DNA 0.5 uL，5×PCR Buffer(含MgCl2)2.5 uL，dNTP(2.5 mmol/L)1 uL，F(xiàn) Primer 0.5 uL，R Primer 0.5uL，Taq DNA聚合酶0.2 uL，最后加dd H2O補至總體積為25 uL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，再72℃延伸10 min，4℃保存[19-20]。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化和測序

PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TIANGEN瓊脂糖回收試劑盒進行膠回收，將目的片段送檢上海生工公司測序。DNA純度用紫外可見分光光度計檢測，獲得OD260和OD280的比值，驗證提取DNA的純度。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和特異性引物的設(shè)計

登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，將擴增序列在BLAST中比對，選取與鑒定菌種相似度在99%以上序列，用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，分析親緣關(guān)系。

從genbank下載紅緣擬層孔菌和木蹄層孔菌的ITS序列，序列號分別為：FJ608588、 KU171405、JX470538.1和JX163102.1。用primer5軟件設(shè)計特異性引物，對ITS序列進行PCR擴增(表1)。

表1 特異性引物的設(shè)計Tab.1 Primers for PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

子實體S1，無柄，菌蓋表面光滑且堅硬，具有褐色膠質(zhì)的皮殼。子實體邊緣鈍圓，菌肉木質(zhì)并呈淡黃色。菌落生長中度較快，3～5周內(nèi)長滿覆蓋平皿，菌落正反面均為白色，菌絲緊貼培養(yǎng)基內(nèi)部均勻生長，邊緣輕微升起呈亞氈狀。具有輕微蘑菇香味，5周后菌落正面略變褐色，背面培養(yǎng)基略變黃色(圖1)。生長新區(qū)的菌絲無色，菌絲較粗，有節(jié)狀分隔和小囊狀體，壁薄，孢子卵形至橢圓形(圖2)。

圖1 木腐真菌S1的子實體和菌落形態(tài)Fig.1 Fruit body and colony morphology of wood-rotting fungi S1

子實體S2，馬蹄形，無柄，菌蓋表面光滑且堅硬，具有灰色角質(zhì)皮殼和明顯同心環(huán)棱。具有木栓質(zhì)的褐色菌肉，子實體背面呈深褐色。菌落生長快速，2～3周內(nèi)長滿覆蓋平皿，菌落中心褐色，周圍白色，平伏貼生于培養(yǎng)基表面生長。菌落正反面顏色一致，無氣味(圖3)。生長新區(qū)菌絲無色，有節(jié)狀分隔和分支，纖維菌絲較多，具有加厚的壁，無分生孢子(圖4)。

圖2 光學(xué)顯微鏡下木腐真菌S1的菌絲照片F(xiàn)ig.2 The mycelium photos of wood-rotting fungi S1 under optical microscope

圖3 木腐真菌S2的子實體和菌落形態(tài)Fig.3 Fruit body and colony morphology of wood-rotting fungi S2

圖4 光學(xué)顯微鏡下木腐真菌S2的菌絲照片F(xiàn)ig.4 The mycelium photos of wood-rotting fungi S2 under optical microscope

根據(jù)《中國真菌志》，初步判斷菌株S1為紅緣擬層孔菌(Fomitopsispinicola)，菌株S2為木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法，主要根據(jù)子實體的形態(tài)，如菌蓋、菌肉、味道等宏觀和菌絲觀察等微觀特征，但一些極其相似的子實體，通過這種方法，有時難以準(zhǔn)確的進行識別。而且不同研究者對同一種菌落、菌絲等觀察和形態(tài)描述可能不同，或者子實的形態(tài)等發(fā)生改變，鑒定結(jié)果可能不準(zhǔn)確。因此本實驗將運用分子生物學(xué)方法，并結(jié)合形態(tài)學(xué)方法進行鑒定。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對木腐真菌分離純化，篩選出兩株目的菌株。根據(jù)滴定愈創(chuàng)木酚的實驗判斷，S1無顯色圈出現(xiàn)，腐朽類型為木材褐腐菌，S2有顯色圈出現(xiàn)，腐朽類型為木材白腐菌。

紫外分光光度計檢測DNA純度，S1：OD260/OD280=1.91，S2：OD260/OD280=1.95，結(jié)果表明DNA純度較高，圖5為提取總DNA電泳檢測結(jié)果和PCR擴增產(chǎn)物片段，S1和S2長度分別為650bp和600bp左右，目的條帶完整，無明顯降解。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，初步鑒定菌株S1為紅緣層孔菌(Fomitopsispinicola)，菌株S2為木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)。圖6為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示S1與NCBI登錄號HM584810.1

序列相似性99%，S2與NCBI登錄號KM584810.1序列相似性99%。

所設(shè)計的特異性引物FNX2和FNX6分別能且僅能擴增出紅緣擬層孔菌和木蹄層孔菌的特異性目的條帶，并可成功擴增出與鑒定菌種相似率95%以上的DNA序列，說明FNX2和FNX6引物具有良好的適用性和特異性，可以在兩種菌種鑒定過程中進行應(yīng)用。

圖5 供試菌株基因組DNA和ITS擴增序列 在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.5 Results of agarose(1%)electrophoresis of genomic DNA on tested product

圖6 木腐真菌S1和S2的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.6 The phylogenetic tree for wood-decaying fungi S1 and S2

3 結(jié)論

本文通過分離和選擇培養(yǎng)對木腐真菌子實體進行分離純化，最終獲得兩種木腐真菌。通過腐朽類型實驗判斷，得出S1為木材褐腐菌，S2為木材白腐菌。通過基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定方法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并設(shè)計特異性引物，初步鑒定木腐真菌S1為紅緣擬層孔菌(Fomitopsispinicola)，S2為木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)。與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，但由于形態(tài)學(xué)方法具有不準(zhǔn)確性，因此可將兩種鑒定方法相結(jié)合，能夠更加準(zhǔn)確、可靠的對木腐真菌進行鑒定。

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IsolationandIdentificationoftwoWood-rottingFungi

Sun Jing1，Qi Dawei1*，Chi Yujie2，Mu hongbo1

(1.College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040； 2.College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Among all the many factors that affect the quality of wood，wood decay caused by wood-rotting fungi is the most serious damage to wood cell wall.In order to identify the pathogens causing wood decay and improve the quality of wood，a molecular biological method for the effective identification of wood-rotting fungi was established.Using collected wood-rotting fungi bodies as studying objects，the target strains were screened by separation and selection of culture medium，then the type of decayed wood-rooting fungi were determined.The DNA was extracted，and Primer5 software was used to design specific primers for sequence amplification.MEGA5.0 software was used to construct phylogenetic tree.And then molecular identification of wood-rotting fungi was carried out at molecular level.Combining with the traditional morphological identification methods used by previous researchers，the morphological characteristics of wood-rotting fungi were observed.The results showed that the wood-rotting fungi S1 wasFomitopsispinicola，and the wood-rotting fungi S2 wasFomesfomentarius.Combining molecular biology methods with traditional morphological methods，wood-rooting fungi can be identified more accurately and reliably.

Wood-rotting fungi；isolation and purification；molecular biology identification；molecular identification

S 782.33

：A

：1001-005X(2017)05-0045-05

2017-04-01

國家自然科學(xué)基金項目(31570712)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12543019)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C201338)；高?？蒲谢痦椖?2572014CB30)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2572016AB26)

孫婧，碩士研究生。研究方向：生物物理。

戚大偉，博士，教授。研究方向：生物物理。

孫婧，戚大偉，池玉杰，等.兩種木腐真菌的分離及鑒定[J].森林工程，2017，33(5)：45-49.