不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)及糖酵解的差異

周曉黎 廖艷 劉浩 楊林 李軼西 黃洋 胡偉 時(shí)昭紅

·論著·

不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)及糖酵解的差異

周曉黎 廖艷 劉浩 楊林 李軼西 黃洋 胡偉 時(shí)昭紅

目的觀察不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor HIF)-1α、糖酵解限速酶表達(dá)的差異及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸濃度的變化。方法將傳代培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞置于不同氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)12小時(shí)，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和western-blot法檢測(cè)HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平；RT-PCR和western-blot法檢測(cè)常氧和缺氧狀態(tài)下結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解限速酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter 1，GLUT-1)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDH-A)基因的表達(dá)。比色法測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞上清液中的乳酸濃度。結(jié)果隨著培養(yǎng)環(huán)境氧濃度下降，結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)逐步增加(P<0.05)，糖酵解限速酶GLUT-1和LDH-A表達(dá)逐步增加(P<0.05)，結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸濃度逐步增高(P<0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境可以上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-1α和GLUT-1、LDH-A的表達(dá)，以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸濃度。隨著氧濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低氧環(huán)境下HIF-1α上調(diào)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

結(jié)腸癌細(xì)胞； 低氧環(huán)境； 缺氧誘導(dǎo)因子-1α

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的危害人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別位居第3位和第4位[1]，且超過(guò)1/3的結(jié)腸癌病人最終發(fā)展至轉(zhuǎn)移性疾病[2]。隨著人口的老齡化、生活環(huán)境及生存環(huán)境中致癌因素的增加，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。我們對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480在常氧及不同低氧濃度下缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor HIF)-1α和糖酵解限速酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter 1，GLUT-1)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDH-A)的基因表達(dá)差異以及細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸濃度的變化進(jìn)行觀察，并探討它們之間的聯(lián)系。

材料與方法

一、材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，HIF-1α、β-actin引物由primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并由英俊公司合成；一抗HIF-1α Antibody(28b)(sc-13515)，LDH-A Antibody(E-9)(sc-137243)，GLUT1 Antibody(A-4)(sc-377228)購(gòu)自santacruz公司；一抗Mouse beta-actin antibody(KM9001)購(gòu)自天津三箭；二抗Goat Anti Mouse IgG antibody及 TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞凍存液：含20%的血清(新生小牛血清、胎牛血清來(lái)自杭州四季青公司)，含10%DMSO的培養(yǎng)基(GIBICO)。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；PCR 儀購(gòu)自Applied Biosystems 公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理：結(jié)腸癌細(xì)胞SW480于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)定為5% CO2，37℃。細(xì)胞傳代貼壁后分別置入不同氧濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)：1% O2，5% CO2，94% N2；5% O2，5% CO2，90% N2；10% O2，5% CO2，85% N2；19% O2，5% CO2，76% N2。培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)。

2.RT-PCR檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α、糖酵解相關(guān)基因GLUT-1和LDH-A mRNA的表達(dá)：收集細(xì)胞(6 孔板，80% 細(xì)胞密度)，13 200 rmp離心5 分鐘，留取上清液；細(xì)胞沉淀中加入1 ml TRIzol，充分混勻，靜置5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加三氯甲烷200 μl，充分混勻，靜置10分鐘，4℃離心，15分鐘。取上清液于另一滅過(guò)菌的EP管內(nèi)，加入等體積4℃的異丙醇，混勻后常溫放置10分鐘后，4℃離心，13 000 rmp，10分鐘；棄上清，管底的白色沉淀即為RNA。加入1 ml 75%乙醇，4℃離心，12 000 rmp，5分鐘。棄上清，再瞬時(shí)離心，吸干管內(nèi)液體，晾干，再加入適量的去離子水溶解。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量。RNA熱變性：取1 μg提取的RNA加入oligo(dT)及RNase Free H2O輕輕混勻，65℃變性10分鐘，后立即置于冰上2分鐘。25℃孵育10分鐘后42℃孵育60分鐘，70℃加熱滅活10 分鐘。-20℃保存。

引物由primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，并由英俊公司合成。HIF1a forward primer：5′-TTT TGG CAG CAA CGA CAC AG-3′，Reverse primer 5′- TGA TTG AGT GCA GGG TCA GC-3′；β-actin forward primer：5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′，Reverse primer 5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GGT-3′ ；GLUT1 forward primer 5′-AAGGCCCTGTTGACGATACC-3′，Reverse primer 5′-GCAGCAGCCTGTGTATGCC-3′；LDH-A forward primer 5′-AGCCCGATTCCGTTACCT-3′，Reverse primer 5′ -CACCAGCAACATTCATTCCA-3′。將引物瞬時(shí)離心；按照說(shuō)明書(shū)加入去離子水，加蓋混勻，配成100μM/L的貯存液；另取一EP管，將上、下游引物稀釋為10.0μM/L終濃度的工作液。反應(yīng)條件：95℃ 10分鐘，95℃ 10秒，60℃ 20秒，72℃ 20秒 40個(gè)循環(huán)。條帶量化通過(guò)photoshop軟件進(jìn)行測(cè)量。

3.Western-blot法檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α、糖酵解相關(guān)基因GLUT-1和LDH-A蛋白的表達(dá)：用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，加入總蛋白提取液，用移液槍頭充分吹打，冰上放置10～20分鐘后，將勻漿液吸出放到1.5 ml離心管中。9 000 rpm離心10分鐘，取適量上清置于新的1.5 ml離心管中。-80℃凍存。采用BCA法測(cè)濃度。將提取的蛋白在100℃加熱3～5分鐘使其充分變性，再用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按預(yù)定順序加樣。蛋白質(zhì)量(蛋白質(zhì)混合物)40 μg。電泳電壓調(diào)至100 V?！叭髦巍狈姌O恒流280 mA轉(zhuǎn)移120分鐘。電轉(zhuǎn)完畢后，將電轉(zhuǎn)膜置于5%的脫脂奶粉(TBST配制)中封閉，磷酸化指標(biāo)用5%的BSA(TBST配制)封閉，37℃ 1小時(shí)。封閉的膜用TBST漂洗2次。一抗孵育4℃過(guò)夜。TBST搖床洗滌5 分鐘。加入二抗孵育1小時(shí)，TBST搖床洗滌5分鐘，將膜風(fēng)干，貼在玻璃紙上，加底物，做化學(xué)發(fā)光，得到膠片，通過(guò)photoshop軟件進(jìn)行量化測(cè)量。

4.比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸的濃度：嚴(yán)格按照乳酸濃度測(cè)定試劑盒步驟操作。收集細(xì)胞培養(yǎng)液2 ml，加入酶工作液1 ml，加入顯色劑0.2 ml，混勻后于37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)10分鐘，加入終止液2 ml，混勻后使用分光光度計(jì)測(cè)吸光度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.不同氧濃度下4組結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA的表達(dá)：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480缺氧環(huán)境培養(yǎng)12小時(shí)后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA表達(dá)量較常氧環(huán)境培養(yǎng)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著缺氧環(huán)境中氧濃度下降，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA表達(dá)量逐步增高，氧濃度10%、5%、1%間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。氧濃度1%組表達(dá)最高。見(jiàn)表1。

2.不同氧濃度下4組結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白的表達(dá)：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480缺氧環(huán)境培養(yǎng)12小時(shí)后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白表達(dá)較常氧環(huán)境培養(yǎng)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著缺氧環(huán)境中氧濃度下降，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白表達(dá)逐步增高，氧濃度10%、5%、1%組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3.不同氧濃度下4組結(jié)腸癌細(xì)胞上清液中乳酸濃度測(cè)定：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480缺氧環(huán)境培養(yǎng)12小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量較常氧環(huán)境培養(yǎng)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著缺氧環(huán)境中氧濃度的下降，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量逐步增高，氧濃度10%、5%、1%間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 不同低氧環(huán)境培養(yǎng)下HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA的表達(dá)

注：與19%氧濃度組比較，aP<0.05；與1%氧濃度組比較，bP<0.05

表2 不同氧濃度環(huán)境培養(yǎng)后HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白的表達(dá)

注：與19%氧濃度組比較，aP<0.05； 與1%氧濃度組相比，bP<0.05

表3 各組細(xì)胞上清液乳酸濃度比較(mmol/L)

注：與19%氧濃度組比較，aP<0.05； 與1%氧濃度組比較，bP<0.05

討 論

缺氧是所有實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)中的共同特征。在缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變代謝方式，來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。

HIF-1是一種機(jī)體適應(yīng)低氧或缺氧的氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于人以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，由 α 和 β 兩個(gè)亞基組成，其中HIF-1α是氧濃度依賴調(diào)控的，在維持機(jī)體適應(yīng)缺氧中起關(guān)鍵作用。HIF-1β 為持續(xù)表達(dá)的蛋白[3-4]。HIF-1α 具有一定的轉(zhuǎn)錄活性和廣泛的靶基因譜，可調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ等編碼基因的表達(dá)，引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。組織細(xì)胞代謝正常時(shí)，HIF-1α處于失活狀態(tài)。當(dāng)處于低氧狀態(tài)時(shí)，HIF-1α轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，使得腫瘤細(xì)胞可以在低氧分壓環(huán)境下通過(guò)改變代謝模式和基因表達(dá)最大程度地獲得供能，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而加速腫瘤生長(zhǎng)。隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平呈指數(shù)增加[7]，與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、抗凋亡、產(chǎn)生耐藥性相關(guān)過(guò)程相關(guān)[8-9]。王遠(yuǎn)等[10]采用免疫組化法檢測(cè)78例大腸腺癌、42例大腸腺瘤和20例癌旁正常組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸腺癌組織中的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率高于大腸腺瘤和癌旁5 cm正常黏膜組織。平偉等[11]采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)HIF-1α及賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 和LOX 在NSCLC 腫瘤組織中表達(dá)均明顯高于癌旁組織，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，提示 HIF-1α和LOX在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，可共同促進(jìn)NSCLC 的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境下大腸癌細(xì)胞中HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于常氧環(huán)境，且氧濃度越低，HIF-1α的表達(dá)量越高。這表明HIF-1α在大腸癌細(xì)胞的無(wú)氧糖酵解過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，并參與了大腸癌的發(fā)生及結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

在乏氧區(qū)域，腫瘤細(xì)胞通過(guò)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞外葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸的和 ATP，LDH-A作用轉(zhuǎn)化為乳酸[12]。乳酸的生成構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞增殖的局部酸性環(huán)境，激活蛋白水解酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)將前基質(zhì)金屬蛋白酶轉(zhuǎn)化為基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)癌細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于腫瘤細(xì)胞對(duì)周?chē)M織的侵襲[13]。段支前等[14]認(rèn)為，腎癌病人血乳酸脫氫酶值隨著腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移逐步升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下大腸癌細(xì)胞表達(dá)GLUT-1、LDH-A mRNA和蛋白的量以及產(chǎn)生乳酸的量均高于常氧環(huán)境，且氧濃度越低結(jié)果越顯著。張永杰等[15]應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)LDH-A蛋白在慢病毒介導(dǎo)的LDH-A siRNA轉(zhuǎn)染腸型胃癌細(xì)胞株SGC7901中表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，LDH-A蛋白在SGC7901細(xì)胞株中的表達(dá)明顯上調(diào)，腸型胃癌組織中LDH-A蛋白的表達(dá)率高于癌旁正常組織。Xu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)的MCF-7 小鼠移植瘤產(chǎn)生更多的乳酸。這表明缺氧促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，而糖酵解可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫逃逸等相關(guān)。

本研究從體外培養(yǎng)細(xì)胞水平上檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境中HIF-1α及糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)變化，以及腫瘤微環(huán)境中乳酸含量的變化。結(jié)果顯示，人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480缺氧環(huán)境培養(yǎng)12小時(shí)后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A的表達(dá)水平較常氧環(huán)境培養(yǎng)增高。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量高于常氧狀態(tài)下的乳酸含量。隨著培養(yǎng)環(huán)境氧濃度的下降，這種差異越顯著。說(shuō)明缺氧環(huán)境促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的糖酵解過(guò)程，這可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)微環(huán)境的適應(yīng)性表現(xiàn)，從而介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。

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ThedifferenceofexpressionofHIF-1αandglycolysisincoloncancinomacellswithdifferentialoxygenconcentration

ZHOUXiaoli，LIAOYan，LIUHao，etal.

(DepartmentofGastroenterology，Wuhanfirsthospital，Wuhan430022，China)

ObjectiveTo research the effect of differential oxygen concentration on the expression of HIF-1α and glycolysis in colon cancinoma cells.MethodsColon cancinoma cells(SW480)were cultured in either a normal environment or a hypoxia environment.SW480 cells were divided into four groups.After the cells were cultured in a hypoxia environment for 12h，the expression of HIF-1α protein was detected by western-blot，and the expression of glycolysis associated genes(GLUT-1，LDH-A) was detected by RT-PCR and western-blot.Colorimetric method was employed to determine the concentration of lactic in cell supernatant.ResultsWith the decreasing of oxygen concentration，the expression of HIF-1α，GLUT-1 and LDH-A was upregulated(P<0.05).The concentration of lactic obviously increased in cell supernatant(P<0.05).ConclusionHypoxia environment can increased the expression of HIF-1α，GLUT-1and LDH-A.It suggested that HIF-1α is associated with the glycosis.

colon cancinoma； hypoxia； hypoxia inducible factor-1α

2017-07-24)

(本文編輯：楊澤平)

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.09.012

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014CC1040)

430022 武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科(周曉黎、廖艷、劉浩、楊林、李軼西、胡偉、時(shí)昭紅)，胃腸外科(黃洋)

時(shí)昭紅，Email：zhaohshi@126.com