吳立春，谷仕艷，代黃梅，張莉，張遵真

(1四川省腫瘤醫(yī)院，成都610041；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院)

長鏈非編碼RNA-ROR在乳腺癌患者血清、癌組織中的表達(dá)變化及其臨床意義

吳立春1,2，谷仕艷2，代黃梅2，張莉1，張遵真2

(1四川省腫瘤醫(yī)院，成都610041；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院)

目的觀察長鏈非編碼RNA-ROR(lincRNA-ROR)在乳腺癌患者血清及癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法選擇行手術(shù)切除治療的乳腺癌患者120例作為觀察組，其中早期55例、中晚期65例；90例體檢健康女性作為對照組。收集觀察組手術(shù)前后及對照組空腹靜脈血，觀察組手術(shù)切除的新鮮癌組織及其配對癌旁正常組織(各24例份)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測兩組血清及組織lincRNA-ROR表達(dá)，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測觀察組早期乳腺癌患者和對照組血清糖類抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)水平。采用受試者工作特征曲線分析血清lincRNA-ROR、CA153、CEA單獨(dú)或聯(lián)合檢測對早期乳腺癌的診斷價(jià)值。結(jié)果觀察組手術(shù)前后血清lincRNA-ROR相對表達(dá)量分別為1.88±0.74、1.01±0.52，對照組為1.31±0.62，兩兩比較P<0.05或<0.01。乳腺癌組織lincRNA-ROR相對表達(dá)量為2.19±0.97，癌旁正常組織為0.79±0.35，二者比較P<0.01。血清lincRNA-ROR診斷早期乳腺癌的曲線下面積(AUC)大于CA153和CEA，敏感性及特異性均高于CA153和CEA；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA聯(lián)合檢測診斷早期乳腺癌的AUC均大于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測，敏感性及特異性均高于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測。結(jié)論乳腺癌患者血清和癌組織中l(wèi)incRNA-ROR表達(dá)均升高；血清lincRNA-ROR表達(dá)檢測有助于乳腺癌的早期診斷及療效判斷。

乳腺癌；長鏈非編碼RNA-ROR；糖類抗原153；癌胚抗原；早期診斷

長鏈非編碼RNA(lincRNA)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要調(diào)節(jié)作用，是可用于腫瘤診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[1，2]。lincRNA-ROR對于多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有重要作用[2]，是一個(gè)新的上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)因子，能誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)揮干細(xì)胞樣作用，并促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[3]。目前，關(guān)于lincRNA-ROR在乳腺癌組織、外周血中的表達(dá)變化及其能否可以作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物的研究報(bào)道較少。本研究觀察了乳腺癌患者血清和癌組織中l(wèi)incRNA-ROR的表達(dá)變化，旨在為乳腺癌的早期篩查及療效判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1～12月于四川省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除治療的乳腺癌患者120例(觀察組)，年齡22～70(47.92±11.11)歲；病理類型：乳腺浸潤導(dǎo)管癌105例、導(dǎo)管內(nèi)癌7例、非特殊類型浸潤性乳腺癌3例、黏液癌5例；乳腺癌早期(腫瘤直徑<3 cm，同側(cè)腋窩無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)55例，中晚期65例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①漢族；②女性；③初次診斷且未接受任何手術(shù)治療、放療、化療及免疫治療；④經(jīng)術(shù)后病理診斷確診為乳腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴其他惡性疾??；②伴急性疾病或急性創(chuàng)傷；③無法耐受手術(shù)。選取同期體檢健康者90例(對照組)，均為女性，年齡(48.44±4.36)歲。兩組年齡具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者及家屬均知情同意。

1.2 標(biāo)本處理 收集空腹靜脈血(5 mL)于分離膠/二氧化硅真空采血管(美國BD公司)中，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清并保存?zhèn)溆?。收集觀察組手術(shù)切除的新鮮癌組織及其配對癌旁正常組織(距腫瘤組織>5 cm)各24例份，迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清及乳腺組織lincRNA-ROR表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照試劑盒說明，分別采用Bioteke法和TRIzol法提取兩組血清及觀察組乳腺組織中的總RNA，gDNA Eraser去除基因組DNA，紫外分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津公司)檢測提取RNA的純度，A260/A280為1.8～2.0視為合格樣品，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測血清和乳腺組織中RNA均完整(電泳條帶清晰，28 S/18 S條帶亮度比值約為2∶1)。采用PrimeScriptTMRTⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 s。參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參，經(jīng)BLAST比對后由上海生工生物工程有限公司合成。lincRNA-ROR：上游引物：5′- CCAGGACAATGAAACCAC -3′，下游引物：5′-AGGAGCCCAAAGTAACAG-3′，產(chǎn)物長度1 592 bp；β-actin：上游引物：5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3′，下游引物：5′-ATCCTTCTGACCCATGCCCA-3′，產(chǎn)物長度129 bp。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)檢測每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后SYBR?Green熒光信號水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lincRNA-ROR相對表達(dá)量。

1.4 血清lincRNA-ROR、糖類抗原153(CA153)和癌胚抗原(CEA)單獨(dú)或聯(lián)合檢測對早期乳腺癌的診斷效能 采用雅培i4000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析儀，以電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測觀察組早期乳腺癌患者術(shù)前與對照組血清CEA和CA153表達(dá)水平，嚴(yán)格按照血清CA153和CEA試劑盒(美國Abbott公司)說明書操作。繪制血清lincRNA-ROR、CA153、CEA單獨(dú)或聯(lián)合檢測診斷早期乳腺癌的受試者工作特征(ROC)曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)、敏感性及特異性。

2 結(jié)果

2.1 血清及乳腺組織lincRNA-ROR表達(dá) 觀察組手術(shù)前后血清lincRNA-ROR相對表達(dá)量分別為1.88±0.74、1.01±0.52，對照組為1.31±0.62，兩兩比較P<0.05或<0.01。觀察組癌組織lincRNA-ROR相對表達(dá)量為2.19±0.97，癌旁正常組織為0.79±0.35，二者比較P<0.01。

2.2 血清lincRNA-ROR、CA153、CEA單獨(dú)及聯(lián)合檢測對早期乳腺癌的診斷價(jià)值 觀察組早期乳腺癌患者術(shù)前與對照組血清lincRNA-ROR相對表達(dá)量分別為1.66±0.69、1.31±0.62，血清CA153水平分別為(17.02±8.64)、(13.24±4.51)U/mL；二者比較P均<0.05。觀察組早期乳腺癌患者術(shù)前與對照組血清CEA水平分別為(13.18±5.55)、(12.22±3.51)ng/mL；二者比較P>0.05。血清lincRNA-ROR診斷早期乳腺癌的AUC均大于CA153和CEA，敏感性及特異性均高于CA153和CEA；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA聯(lián)合檢測診斷早期乳腺癌的AUC均大于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測，敏感性及特異性均高于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測。見表1。

表1 血清lincRNA-ROR、CA153、CEA單獨(dú)或聯(lián)合檢測對早期乳腺癌的診斷價(jià)值

3 討論

lincRNA可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面上調(diào)控基因表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤的生長、增殖、侵襲、播散、遷移及預(yù)后相關(guān)[5,6]。研究顯示，lincRNA-ROR參與細(xì)胞生長發(fā)育、分化代謝等多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，在癌癥進(jìn)程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的生物學(xué)特性[7]，在肝癌[8]、胰腺癌[9]、膀胱癌[10]、乳腺癌[3]組織及其細(xì)胞系中異常高表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)[11]。Hou等[3]研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-ROR表達(dá)與乳腺癌的病情有關(guān)，沉默lincRNA-ROR可抑制腫瘤生長和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并通過調(diào)控miR-205、miR-145等影響細(xì)胞分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等[12]。

核酸可穩(wěn)定表達(dá)于人體外周循環(huán)系統(tǒng)中，以microRNA為代表的循環(huán)核酸可作為乳腺癌較新的診斷標(biāo)志物[13]。研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的長鏈非編碼基因HOTAIR表達(dá)水平可動(dòng)態(tài)監(jiān)測乳腺癌患者體內(nèi)腫瘤情況，其高表達(dá)可作為乳腺癌轉(zhuǎn)移和患者死亡的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[14]。lincRNA-ROR可通過沉默miR-34a的表達(dá)抑制吉西他濱誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡；lincRNA-ROR表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致乳腺癌化療耐受，是乳腺癌多重耐藥的一個(gè)標(biāo)志物。本研究觀察組癌組織lincRNA-ROR相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，術(shù)前血清lincRNA-ROR相對表達(dá)量明顯高于對照組；說明乳腺癌患者血清和癌組織中l(wèi)incRNA-ROR表達(dá)均升高。本研究觀察組術(shù)后lincRNA-ROR相對表達(dá)量明顯低于術(shù)前，提示血清lincRNA-ROR表達(dá)可動(dòng)態(tài)反映乳腺癌患者體內(nèi)的腫瘤情況，血清lincRNA-ROR表達(dá)可用于手術(shù)效果評價(jià)和腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)控，有助于指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。

CA153和CEA是傳統(tǒng)乳腺癌篩查、診斷及預(yù)后監(jiān)測的血清學(xué)指標(biāo)[4]。但乳腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，與多種基因調(diào)節(jié)異常和信號通路改變密切有關(guān)，而常規(guī)乳腺癌單一檢測指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確性有限，容易漏診，臨床上通常采用聯(lián)合檢測以提高診斷準(zhǔn)確率。本研究結(jié)果顯示，血清lincRNA-ROR診斷早期乳腺癌的AUC均大于CA153和CEA，敏感性及特異性均高于CA153和CEA，說明單項(xiàng)指標(biāo)檢測時(shí)血清lincRNA-ROR對早期乳腺癌的診斷價(jià)值較高；血清lincRNA-ROR、CA153、CEA聯(lián)合檢測診斷早期乳腺癌的AUC均大于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測，敏感性及特異性均高于上述指標(biāo)單獨(dú)檢測，說明上述指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷早期乳腺癌的價(jià)值高于單獨(dú)檢測。以上均表明血清lincRNA-ROR可作為乳腺癌早期診斷的一個(gè)潛在分子標(biāo)志物。

綜上所述，乳腺癌患者血清和癌組織中l(wèi)incRNA-ROR表達(dá)均升高，lincRNA-ROR表達(dá)檢測有助于乳腺癌的早期診斷及療效判斷。lincRNA-ROR作為早期乳腺癌的一個(gè)新型分子標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)，其臨床價(jià)值仍待進(jìn)一步探索。

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國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81372945)。

張遵真(E-mail： zhangzunzhen@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.025

R737.9

B

1002-266X(2017)32-0078-03

2016-09-30)