劉寬亮　趙志常　高愛平

摘要：肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷合成途徑的關(guān)鍵酶之一，其蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度直接影響植物中黃酮類化合物和芳香族化合物的生物合成量。根據(jù)已經(jīng)報道的C4H基因的序列設計兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果實C4H基因的全長cDNA序列為1 680 bp。該基因開放閱讀框為1 518 bp，編碼505個氨基酸，分子量為58.08 ku。蛋白等電點為9.52，分析發(fā)現(xiàn)該基因主要定位在線粒體中。通過軟件預測得到3種三級蛋白結(jié)構(gòu)圖；通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與橄欖、可可等植物具有較近的親緣關(guān)系。對不同著色的芒果品種的C4H基因表達進行分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達量最高，而綠色的桂七品種中表達量最低。

關(guān)鍵詞：芒果； C4H基因；克隆；蛋白質(zhì)；生物信息

中圖分類號： S667.701文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0008-04

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，簡稱C4H），別稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，是細胞色素單加氧酶P450超家族的成員之一[1]，該酶由Russell等首次從豌豆芽中發(fā)現(xiàn)[2]，它是苯丙素類化合物生物合成途徑里繼苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanineammonia-iyase，簡稱PAL）之后的第2個關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，其作用是將苯丙氨酸途徑的合成酶復合物固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[3]；同時，在氧和磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，簡稱NADP）存在下，將反式肉桂酸苯環(huán)的4位羥基化生成對-香豆酸[4]。C4H分布在微粒體中，能夠原位利用PAL催化產(chǎn)生的苯乙烯酸。普遍認為，肉桂酸-4-羥化酶是苯丙素類物質(zhì)代謝中一個調(diào)節(jié)點[2]。由于肉桂酸-4-羥化酶基因在植物次生代謝中有這些重要的作用，因此被廣泛關(guān)注。自上世紀80年代以來，肉桂酸-4-羥化酶的基因克隆逐漸成為一個研究熱點。迄今，已有擬南芥、大豆、花生、杜仲等50多種植物的C4H基因被分離出來[5-10]。與苯丙氨酸脫氨酶基因類似，肉桂酸-4-羥化酶基因的拷貝數(shù)在不同植物之間存在差異。如：苜蓿C4H基因有2個拷貝，豌豆的C4H基因只有1個拷貝，綠豆和長春花的C4H基因家族都有多個成員。這些不同植物種的C4H基因所編碼的氨基酸序列相似性極高，同源性普遍在85%左右。但玉米和法國菜豆中的2個C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60%[11]。C4H基因在植物各組織中均具有很高的活性[11-14]，研究表明，C4H的蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度直接影響植物中黃酮類化合物、木質(zhì)素、芳香族類化合物的合成等多條代謝途徑[15-16]。芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹，果實色彩多樣，有綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等。芒果果實富含類胡蘿卜素、花色素苷等物質(zhì)，其中花色素苷合成途徑是紅色芒果果實著色的一個主要的代謝途徑。芒果果實C4H基因的研究工作未見報道，本研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，簡稱RACE）從芒果的果實中克隆得到1個C4H基因，深入探討該基因在芒果果實花色素苷合成的作用機制及其對果實著色的影響，借以深入揭示該基因在芒果果實花色素苷生物合成的分子機制，以期為芒果果實著色研究提供一定理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用芒果（品種有紅色貴妃、黃色金煌、綠色桂七）果實取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部芒果種質(zhì)資源圃。引物委托上海英俊生物工程技術(shù)服務有限公司合成，其他藥品如：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，簡稱為IPTG）、酵母抽提物（yeast extract，簡稱YE）、氨芐青霉素（ampicillin，簡稱為Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（簡稱為X-GaL）、pMD-19T載體及各種酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1芒果總RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒用RNase-free無菌水溶解，并用寶生物工程（大連）有限公司的DNase試劑盒進行DNA去除，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和DNA是否去除干凈。

1.2.2PCR反應程序94 ℃預變性4 min；95 ℃變性50 s，50 ℃復性50 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸 7 min； 反應體系為25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs；[JP3]擴增反應結(jié)束后取10 μL進行擴增產(chǎn)物的電泳，采用gelred染色后在紫外凝膠成像儀上觀察、拍照分析。

1.3C4H基因全長cDNA序列的獲得

以貴妃芒果的果實總RNA作為模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并參照該試劑盒的說明書進行cDNA 3′端、5′末端 cDNA 的擴增。根據(jù)cDNA片段的測序結(jié)果，分別設計2條上游引物，以接頭為錨定引物進行半巢式PCR反應。根據(jù)測得的片段和得到的cDNA 3′端、5′末端的序列結(jié)果拼接該基因的全長 cDNA。以cDNA為模板，設計特異引物，進行全長cDNA序列擴增反應。

1.4C4H基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和分子進化的分析

將測得的全長cDNA序列進行NCBI序列比對，確定該全長序列是否為C4H基因，并進行其他物種C4H基因的比對，采用DNAMAN軟件分析基因核苷酸、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和同源性；分析該基因所推定氨基酸序列進行多序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)樹。endprint

1.5表達分析

分別提取不同芒果品種的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，并采用Primer 5.0設計引物進行RT-PCR的擴增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為：actin-F 5′-AATGGAACTGGAATG GTCAAGGC-3′，actin-R5′-TGCCAGATCTTCTCCATGTCA TCCCA-3′；目的基因擴增采用的引物為：C4H-F，5′-CAGCATAGCCTAGCACATACTC-3′，C4H-R 5′-CAATG GAGCATATACGAAACTAT-3′，PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并采用Quantity One軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算相對表達量。

2結(jié)果與分析

2.1C4H基因的獲得

根據(jù)RACE擴增結(jié)果進行拼接最后得到C4H基因的全長cDNA序列，電泳收測序后全長序列為1 680 bp，分析發(fā)現(xiàn)，開放閱讀框為1 518 bp，編碼505個氨基酸序列（圖1）。通過NCBI上已經(jīng)登錄的水稻、大豆、橄欖、可可的C4H蛋白序列進行比對（圖2）發(fā)現(xiàn)，克隆的基因為C4H基因。

利用NCBI的Blast進行保守區(qū)查找，獲得序列的保守Domain（CD）。結(jié)果表明，C4H有PLN02394（trans-cinnamate 4-monooxygenase）、p450（cytochrome P450）、CypX（secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism）P450_cycloAA_1（cyclodipeptide synthase-associated）、PLN02738（carotene beta-ring hydroxylase）等結(jié)合域。對其蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測發(fā)現(xiàn)，芒果C4H蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以蛋白二級結(jié)構(gòu)元件以α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲為主，也具有少量的β-折疊結(jié)構(gòu)（圖4）。采用Bioedit軟件的Kyte和Doolittle算法對C4H蛋白的親水/疏水性（正值表示疏水性，負值表示親水性）進行分析，C4H蛋白所含氨基酸的值主要介于-2.2～31之間（圖5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件對C4H蛋白進行定位預測發(fā)現(xiàn)，該基因定位在線粒體中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，推導出該蛋白有3種結(jié)構(gòu)構(gòu)型（圖6）。采用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，芒果C4H蛋白與橄欖、可可等植物具有較近的親緣關(guān)系（圖7）。

2.3C4H基因的RT-PCR分析

對不同著色品種的芒果果皮進行RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在紅色果皮貴妃的果實中表達較多，黃色果皮金煌的果實中次之，而綠色果皮桂七的果實中相對表達較少（圖8），初步推斷C4H基因可能與紅色果實的花色素苷合成有密切的關(guān)系。

3討論

本研究成功地從芒果果實中分離得到1個全長C4H基因，該基因cDNA的開放閱讀框為1 518 bp，編碼505個氨基酸。通過在線軟件對cDNA和蛋白序列分析證實該序列是植物C4H基因的一員。芒果C4H基因與所選其他物種C4H基因序列相比較發(fā)現(xiàn)，無論在全長cDNA序列上還是在其編碼氨基酸序列上都具有較高保守的結(jié)構(gòu)域細胞色素P450。同時，通過與其他部分物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，芒果C4H基因編碼的蛋白與橄欖、可可、棉花等植物聚為一類。植物黃酮類物質(zhì)的生物合成相關(guān)的蛋白一般定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，由一系列特定的黃酮合成相關(guān)酶組成的多酶復合體連續(xù)合成并轉(zhuǎn)運到特定的亞細胞結(jié)構(gòu)中[17]。C4H蛋白的N-末端的膜錨定信號基（signal-anchor sequence），使其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，參與苯丙烷類代謝途徑中多酶復合體的亞細胞定位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上電子鏈的化學傳遞[18]，進而進行黃酮類物質(zhì)的生物合成。Baek等在黑莓中發(fā)現(xiàn)，黃酮積累量與C4H表達量在果實發(fā)育的不同時期表現(xiàn)了同步增加或減少的變化趨勢[19]。本研究對芒果不同果實著色分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達量最高，而綠色的桂七品種中表達量最低，這與花色素苷的含量有一定的相關(guān)性。在大蒜中C4H的轉(zhuǎn)錄在根中最高，而在苯丙素類物質(zhì)富集的莖中卻很低。推測大蒜中苯丙素類物質(zhì)可能在根部合成后轉(zhuǎn)運到莖中[20]。在逆境脅迫下，植物可通過調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響其黃酮類和芳香族類的合成和積累[8]，其中就包括C4H。Ryan等在矮牽?；ㄖ械难芯堪l(fā)現(xiàn)，在UV-B脅迫處理下，C4H等基因表達量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加[21]。Liu等發(fā)現(xiàn)K離子缺乏誘導的菊花中C4H等基因的表達量減少，造成了該部位黃酮含量的降低[22]。芒果C4H基因是芒果花色素苷合成代謝途徑中的一個關(guān)鍵的基因，對芒果果皮紅色的形成具有重要的作用。芒果果實的著色也受得了光照、溫度等條件的影響，這些因素是否影響了C4H基因的表達，同時，對該基因功能的深入研究須要進一步進行轉(zhuǎn)基因植物表達驗證。

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