劉華 歐陽(yáng)學(xué)認(rèn) 張雪麗 高欣 戴玲穎 范茜茜 陳思韻 胡澤濤

異功散早期干預(yù)對(duì)支氣管哮喘幼年小鼠氣道炎癥的影響

劉華 歐陽(yáng)學(xué)認(rèn) 張雪麗 高欣 戴玲穎 范茜茜 陳思韻 胡澤濤

目的 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),研究異功散早期干預(yù)對(duì)支氣管哮喘幼年小鼠氣道炎癥的影響,以探索中醫(yī)藥防治支氣管哮喘的機(jī)制。方法 選取7日齡BALB/c品系雌性小鼠24只,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和異功散組共3組。以卵蛋白誘導(dǎo)法建立幼年小鼠的哮喘模型,觀察幼鼠的一般情況、肺組織病理(HE染色)及肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF)中白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)和 IL-17 的變化(ELISA法)。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較,異功散組的肺組織損傷減輕;與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組和異功散組 BALF中 IL-10、TGF-β1均顯著降低(P＜0.05),而 IL-17則顯著增高(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,異功散組IL-10顯著增高(P＜0.05),IL-17降低(P＜0.05),而TGF-β1則無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)論 異功散可減輕哮喘模型幼鼠的氣道炎癥,提高肺泡灌洗液中IL-10、減少IL-17的含量。

異功散; 支氣管哮喘; 氣道炎癥; 細(xì)胞因子; 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)是兒童時(shí)期常見(jiàn)的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病,在嬰幼兒期,臨床兒科醫(yī)師難以做出明確診斷。有資料顯示,嬰幼兒期的哮喘發(fā)病率逐年攀升,其中約50%兒童持續(xù)哮喘患者的喘息癥狀發(fā)生在3歲以前,且較諸年長(zhǎng)兒控制情況較差[1]。吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroid,ICS)等治療可對(duì)兒童哮喘的癥狀和肺功能明顯改善,但對(duì)于疾病的自然病程,并不能改變[2]。此外,由于鑒別診斷方面的障礙,對(duì)于嬰幼兒期的反復(fù)喘息,是否及何種程度上使用 ICS,仍存在較大爭(zhēng)議[3]。因此,如何更有效地早期防治哮喘,特別是嬰幼兒哮喘,是臨床上急待解決的難題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究“培土生金法”的代表方—異功散早期干預(yù)對(duì)哮喘幼年小鼠氣道炎癥的影響,探索中醫(yī)藥防治哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

7日齡 BALB/c雌性小鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(3.35±0.45)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)分配法,分成3組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組及異功散組,每組8只。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物及試劑

異功散按《小兒藥證直訣》的原方(人參、茯苓、白術(shù)、陳皮、甘草)1∶1∶1∶1∶1比例配方,各6 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,制成水煎劑,并配成含生藥約1 g/mL的溶液,充分?jǐn)噭?貯于4℃冰箱備用。

白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)及IL-17的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒,上海酶研生物科技有限公司,批號(hào)：EK-M20156。

1.3 儀器

CMIAS系列多功能真彩分析系統(tǒng),由北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司提供。

1.4 造模與給藥

異功散組和模型對(duì)照組于第1、12天腹腔注射由10%卵蛋白溶液0.1 mL與等體積佐劑液態(tài)鋁混合的致敏液0.2 mL,第18～23天將致敏小鼠置于20 cm×20 cm×30 cm的密閉容器,用3%的卵蛋白溶液10 mL霧化,每天1次,吸入20分鐘。小鼠出現(xiàn)噴嚏頻繁、安靜少動(dòng)、煩躁不安、弓背、抓鼻、前肢縮抬、呼吸急促、喘息等,是哮喘造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

建模同時(shí),異功散組以每只每次15 g/kg體重灌服異功散水煎液(稀釋為25 mL/kg后灌服),每天灌胃給藥1次,連續(xù)24天。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組均灌以等量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與指標(biāo)測(cè)定

造模結(jié)束,第24天處死小鼠：暴露胸腔,仰臥位,留置針插入氣管,結(jié)扎右側(cè)的主支氣管,用0.3 mL生理鹽水,灌洗5次,支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF),4℃離心后取上清液,-20℃保存?zhèn)溆?。摘取未灌洗的左肺組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片后行HE染色,在鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

ELISA法檢測(cè) BALF中 IL-10、IL-17和 TGF-β1水平,具體步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,服從正態(tài)分布且方差齊用單因素方差分析,不符合正態(tài)用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,異功散組死亡1只,剩余7只,其平均體重為(7.75±0.64)g;模型對(duì)照組及空白對(duì)照組均無(wú)死亡,其平均體重分別為(7.45±0.50)g及(7.50±0.62)g。

HE染色后,空白對(duì)照組中,小鼠肺組織病理變化不明顯,組織結(jié)構(gòu)完整清晰,肺泡的結(jié)構(gòu)完整,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖1A;模型對(duì)照組可見(jiàn)明顯病理變化,支氣管管壁的結(jié)構(gòu)破壞,肺泡壁的毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量浸潤(rùn),見(jiàn)圖1B;異功散組中,肺組織和支氣管管壁,可見(jiàn)輕到中度損傷,肺泡壁毛細(xì)血管有輕中度擴(kuò)張、充血,炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞部分浸潤(rùn),見(jiàn)圖1C。

圖1 對(duì)哮喘小鼠肺組織影響的病理HE切片圖

2.2 BALF中IL-10、TGF-β1和IL-17含量的比較

與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組和異功散組BALF中 IL-10、TGF-β1 均顯著降低(P＜0.05),而IL-17則顯著增高(P＜0.05);與模型對(duì)照組比較,異功散組 IL-10顯著增高(P＜0.05),IL-17降低(P＜0.05),而 TGF-β1 則無(wú)顯著差異(P＞0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組BALF中細(xì)胞因子的濃度(x±s,pg/L)

4 討論

兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全明確。機(jī)體輔助性T淋巴細(xì)胞1型(Th1)/輔助性T淋巴細(xì)胞2型(Th2)平衡失調(diào)的理論并不能完全解釋哮喘的發(fā)病,而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)、輔助性T淋巴細(xì)胞17型(Th17)細(xì)胞和哮喘的相關(guān)性,越來(lái)越得到重視[4]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等,抑制T細(xì)胞增殖,抑制Th1、Th2的相關(guān)細(xì)胞因子反應(yīng),可減輕炎癥[5]。Th17細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子、哮喘發(fā)病相關(guān)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員—IL-17,其表達(dá)在哮喘發(fā)生上調(diào),可參與哮喘氣道重構(gòu)[6]。

中醫(yī)藥治療哮喘歷史悠久,尤其是在哮喘防治方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)的重要內(nèi)容之一—“肺脾相關(guān)”理論,在指導(dǎo)肺系相關(guān)疾病的診斷及治療意義重大。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,“痰”為哮喘病之夙根,只是哮喘發(fā)作的病理因素,而脾胃虛弱則是貫穿哮喘病發(fā)作期與緩解期總病程的核心病機(jī),因此,培土生金法廣泛應(yīng)用于哮喘病的預(yù)防治療。小兒具有“臟腑嬌嫩,形氣未充”的生理特點(diǎn),臨床所見(jiàn)小兒哮喘單純腎虛者較少,而其“肺常不足”“脾常虛”的生理、病理特點(diǎn)更顯突出。因此,培土生金法也成為防治兒童哮喘的重要治法。運(yùn)用培土生金法的原則治療哮喘,在提高哮喘患兒機(jī)體免疫力、減少哮喘發(fā)作次數(shù)、減輕發(fā)作程度、提高生存質(zhì)量方面有其突出優(yōu)勢(shì)[7-9]。在該理論指導(dǎo)下,異功散—作為調(diào)理小兒脾胃功能的經(jīng)典方劑之一,也被廣泛運(yùn)用于支氣管哮喘等肺系疾病的防治。

本研究結(jié)果提示,異功散的早期防治,減輕了哮喘模型幼年小鼠的氣道炎癥反應(yīng)程度,這可能與其對(duì)CD4+CD25+Treg/Th17功能的調(diào)控相關(guān)(例如：增強(qiáng)IL-10或降低IL-17的表達(dá))。既往有研究表明,健脾益氣方藥,調(diào)節(jié)哮喘模型大鼠的Th1/Th2失衡,對(duì)體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的水平有降低作用,能減輕肺組織炎癥細(xì)胞的局部浸潤(rùn),抑制氣道的炎癥,減少哮喘發(fā)作[10],本研究結(jié)果與此相一致。

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Effect of early intervention with Yi Gong powder on airway inflammation in young mice with bronchial asthma

LIU Hua,OUYANG Xueren,ZHANG Xueli,et al.
The first affiliated hospital of Guangzhou univercity of traditional Chinese medicine,Guangdong 510000,China

LIU Hua,E-mail： liuhua0321@126.com

Objective To study the effects of early intervention with Yi Gong powder on airway inflammation in bronchial asthma rats,in order to explore the mechanism of traditional Chinese medicine in preventing and treating bronchial asthma.Methods 24 female BALB/c mice of 7 days old were selected,and the mice were randomly divided into the blank control group,the model control group and the Yi Gong powder group.Asthma model of young mice was induced by ovalbumin.The general situation,pulmonary pathology(HE stain),and the changes of interleukin 10(IL-10),interleukin 17(IL-17)and transforming growth factor-beta1(TGF-β1)in bronchial alveolar lavage fluid(BALF)was observed.Results (1)Compared with model group,the lung tissue injury was alleviated in the Yi Gong powder group(P＜0.05).(2)Compared with the blank control group,IL-10 and TGF-β1 was markedly decreased in the model control group and the Yi Gong powder group(P＜0.05)while the IL-17 were markedly increased(P＜0.05).Compared with model control group,IL-10 of the Yi Gong powder group was markedly increased(P＜0.05)while the IL-17 was markedly decreased(P＜0.05),and there was no significance in TGF-β(P＞0.05).Conclusion Yi Gong powder can increase the content of IL-10,and decrease the content of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid of asthmatic mice.

Yi Gong powder; Bronchial asthma; Airway inflammation; Cell factor;Animal experiment

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.10.002

2017-04-14)

(本文編輯：禹佳)

廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313410)

510000 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(劉華、歐陽(yáng)學(xué)認(rèn)、張雪麗);廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(高欣);廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(戴玲穎、范茜茜、陳思韻、胡澤濤)

劉華(1975-),女,博士,副主任中醫(yī)師。研究方向：小兒肺脾相關(guān)疾病。E-mail：liuhua0321@126.com