提高有絲分裂實驗效果的嘗試

楊遠媛 趙京秋

（1北京市第三十五中學 北京 100035 2北京市西城區(qū)教育研修學院 北京 100000）

“植物細胞有絲分裂觀察實驗”為高中生物學必修1第6章第1節(jié) “細胞增殖”部分的實驗內容，是學生在學習了細胞生命系統(tǒng)的物質組成、結構和功能之后，認識細胞的產(chǎn)生、發(fā)展和消亡的過程。其中細胞的有絲分裂是學生后續(xù)學習減數(shù)分裂和遺傳規(guī)律的基礎，也是學習DNA復制及遺傳信息傳遞的重要基礎。本實驗的實驗目的是讓學生學會運用根尖壓片技術，制作臨時裝片，學會辨認洋蔥根尖細胞分裂各時期的染色體特征。實驗涉及材料的準備和培養(yǎng)、裝片的制作、顯微鏡的使用、實驗數(shù)據(jù)的處理等多方面的技能訓練［1］。做好這一實驗有助于促進學生理解實驗各個步驟的意義，掌握有絲分裂各個時期的特征，提升學生對有絲分裂的理解和對生物學科的興趣，達到培養(yǎng)學生生物學素養(yǎng)的目的。

本實驗傳統(tǒng)方法包括常溫水培、取材、解離、漂洗、染色、壓片等步驟［2－3］。 但在 實際教學實踐中，筆者發(fā)現(xiàn)學生實驗的成功率較低，分析其原因主要包括2個方面：在常規(guī)培養(yǎng)條件下植物洋蔥根尖最高有絲分裂指數(shù)為4.22%［4］，有絲分裂指數(shù)較低，導致學生難以觀察到各個時期的細胞；同時實驗操作步驟多，每一步操作都有較多注意事項，各個環(huán)節(jié)都將直接影響實驗的成功與否。因此本研究通過應用同步化技術從根本上提高植物細胞有絲分裂指數(shù)，同時改進實驗步驟，改善整個實驗的效果，提高實驗的成功率。

1 實驗準備

1.1 實驗材料及器材

1）實驗材料：洋蔥根尖。

2）實驗試劑：1.25 mmol羥基脲溶液、卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）、酒精（95%）、解離液、清水、0.01 g/mL龍膽紫溶液。

3）實驗儀器：顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，剪刀，滴管，吸水紙。

1.2 實驗材料的準備

1.2.1 實驗材料的水培 傳統(tǒng)實驗為常溫水培1周，筆者改進為常溫+低溫水培的方法，具體的做法為將洋蔥在常溫條件下水培1周，然后再放入4℃冰箱中培養(yǎng)1個月。如此處理可讓洋蔥長出許多根，且每條根都特別粗壯，避免根在長期常溫培養(yǎng)條件下變細的缺點，一個洋蔥即可滿足40人左右班級的需要，極大減少了實驗材料的準備工作。

圖1 洋蔥根對照組常溫水培和實驗組常溫+低溫水培的對比

1.2.2 根的同步化處理 利用化學試劑羥基脲進行同步化處理，可成倍提高根尖有絲分裂指數(shù)，具體操作如下：將0.095 g的羥基脲溶于1 L清水中制成1.25 mmol的羥基脲水溶液，將洋蔥根置于該水溶液中培養(yǎng)28 h后，用清水清洗根5次，每次3 min，以此去除阻斷劑，最后將根放入清水中恢復培養(yǎng)4～9 h。

1.2.3 固定 將有絲分裂指數(shù)處于較高時期的根尖剪下，用吸水紙吸干水分，將其放入卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定4 h以上。固定完畢后將根尖取出，再用吸水紙吸干液體。最后將根尖放入酒精中，在4℃冰箱中保存待用，注意保存時間不超過2個月。如果洋蔥根尖細胞同步化后的恢復期恰好是實驗課上課時間，固定這一步也可省略。

以上實驗準備工作由教師完成，準備時間約為2 d，該操作可節(jié)省課堂制片時間，顯著提高實驗的成功率。

2 實驗步驟

2.1 解離 與傳統(tǒng)實驗解離10 min相比，由于課前教師已完成了固定，此時將根尖取出只需用解離液處理5 min。注意要掌握好時間，如果時間過長，則易使分生區(qū)和伸長區(qū)脫節(jié)，不利于操作；過時間短則解離不足，壓片時細胞不易分散。

2.2 漂洗 為了減少傳統(tǒng)步驟中頻繁更換燒杯和試劑等，本實驗改進為在一片載玻片上完成所有實驗的方法。具體操作為：滴加完解離液后，用吸水紙吸干液體，再滴加清水3次漂洗，每次1 min。這種方法操作簡單方便，節(jié)省試劑，同時也減少解離后材料的移動和丟失。

2.3 染色 傳統(tǒng)方法使用龍膽紫染色液對洋蔥根尖細胞染色10 min，但染色效果不理想，很容易使細胞內的其他物質也著色。注意本實驗為了改善染色效果，改為用質量分數(shù)為1%的龍膽紫溶液染色5 min后，再多加1個步驟：滴加解離液分色，分色時間為1 min。分色的原理是用解離液脫去細胞核中結合過多的染料和細胞漿中吸附的染料，以此去掉細胞內其他物質的著色，使細胞核和染色體著色更清晰可見。

2.4 壓片 吸取多余染液和分色液，滴加1滴清水，小心蓋上蓋玻片，注意防止產(chǎn)生氣泡。然后再覆蓋吸水紙，用左手固定蓋玻片，以免移位，右手拇指輕壓蓋玻片，使細胞分散，用吸水紙吸干多余的液體，即可觀察。

2.4 改進后的實驗步驟與傳統(tǒng)實驗的區(qū)別 與傳統(tǒng)實驗比較，改進實驗做了如下系統(tǒng)調整：傳統(tǒng)實驗為常溫水培，改進為常溫+低溫水培的方法，傳統(tǒng)實驗直接取材改進為同步化、固定后取材，同時還縮短了解離時間，簡化漂洗用具，為了改善染色效果，在染色后多加1個分色步驟。

3 實驗結果

植物細胞同步化技術是以藥物或低溫處理打亂細胞的分裂周期，使多數(shù)細胞同時停留在分裂周期的某一階段［5］。本研究為了提高洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數(shù)，利用化學試劑HU（Hydroxyurea）阻斷法［6，7］誘導了多數(shù)洋蔥根尖分生區(qū)細胞同時停留在S期，通過清水洗脫去除HU阻斷，使多數(shù)細胞同步化進入有絲分裂的下一個時期，以此達到提高有絲分裂指數(shù)的目的。通過顯微觀察統(tǒng)計多個視野中1 000以上洋蔥根尖細胞有絲分裂指數(shù)發(fā)現(xiàn)：1.25 mmol的羥基脲同步化處理洋蔥根尖28 h后，恢復培養(yǎng)4 h根尖細胞有絲分裂指數(shù)達12%，其中前期細胞較多，恢復培養(yǎng)9 h有絲分裂指數(shù)達到11%。其中中后期細胞較多（表1、表2）。對比觀察傳統(tǒng)實驗和改進實驗后的前期、中期、后期、末期的細胞（圖2～圖 11），筆者發(fā)現(xiàn)通過同步化處理洋蔥根尖細胞各時期分裂指數(shù)提高了3倍以上，從根本上解決了洋蔥根尖細胞的有絲分裂指數(shù)較低、實驗成功率較低的難題。同時改進后的實驗步驟當中，水培、同步化、固定由實驗教師完成。解離、漂洗、染色、分色、壓片由學生在課堂上完成，制片時間約為15 min。按照改進后的實驗步驟操作使得所需實驗材料減少，實驗準備工作量減小，洋蔥根尖細胞絲分裂指數(shù)提高，細胞染色體著色清晰便于觀察，有絲分裂制片步驟簡化，學生操作簡單方便，因此實驗成功率顯著提高。

表1 1.25 mmol羥基脲處理28 h恢復培養(yǎng)5 h后有絲分裂各時期統(tǒng)計

表2 1.25 mmol羥基脲處理28 h恢復培養(yǎng)9 h后有絲分裂各時期統(tǒng)計

圖2 傳統(tǒng)方法實驗后洋蔥根尖間期細胞（400×）

圖3 改進方法實驗后洋蔥根尖間期細胞（400×）

圖4 傳統(tǒng)方法實驗后洋蔥根尖前期細胞（400×）

圖6 傳統(tǒng)方法實驗后洋蔥根尖中期細胞（400×）

圖7 改進方法實驗后洋蔥根尖中期細胞（400×）

圖8 傳統(tǒng)方法實驗后洋蔥根尖后期細胞（400×）

圖9 改進方法實驗后洋蔥根尖后期細胞（400×）

圖10 傳統(tǒng)方法實驗后洋蔥根尖末期細胞（400×）

圖11 改進方法實驗后洋蔥根尖末期細胞（400×）

4 本實驗的教學安排

本實驗安排在學生已經(jīng)學習了 “細胞增殖”有關內容理論知識的基礎上，學生對于細胞的分裂過程及各個分裂時期的染色體形態(tài)已有系統(tǒng)了解。通過本實驗教學能讓學生復習、鞏固相關實驗操作技能，深化對于有絲分裂過程的理解和認識。但由于常規(guī)實驗條件下植物根尖細胞有絲分裂指數(shù)較低、實驗的操作繁瑣等原因使學生實驗的成功率較低，傳統(tǒng)教學按照驗證實驗的方法教學難以獲得較好效果。因此筆者嘗試進行小組合作式探究實驗教學，具體的教學過程為：在學生按照傳統(tǒng)書本實驗操作后，根據(jù)實驗中出現(xiàn)的問題，分小組分析實驗失敗的原因，提出改進實驗步驟這一探究性課題。通過課題引導學生分小組探究改進實驗步驟，小組展示探究成果。最后教師小結并加入同步化技術系統(tǒng)改進實驗方案，指導學生按照改進后的實驗步驟當堂操作，對比效果。小組合作式探究實驗教學不僅能指導學生分析實驗中每一步驟的作用、原理及技巧，深刻理解實驗步驟的科學性和嚴密性，從中學習研究事物、解決問題的方法，同時也能讓學生在一節(jié)課內觀察到有絲分裂各個時期的細胞，并嘗試對其進行排序，加深學生對有絲分裂整個過程及其各個時期特點的理解。小組合作式探究實驗能將理論知識的學習延伸到科研實踐，在潛移默化中培養(yǎng)了學生的科學精神和嚴謹?shù)目茖W態(tài)度，讓學生體會到學以致用的快樂。