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      TNF-α/NF-κB信號通路在依那西普緩解大鼠類風濕性關節(jié)炎中的作用*

      2017-10-14 07:53:30劉彩麗王穎瑛
      中國應用生理學雜志 2017年4期
      關鍵詞:那西普胞漿足趾

      劉彩麗, 王穎瑛

      (安陽市婦幼保健院檢驗科, 河南 安陽 455000)

      TNF-α/NF-κB信號通路在依那西普緩解大鼠類風濕性關節(jié)炎中的作用*

      劉彩麗, 王穎瑛△

      (安陽市婦幼保健院檢驗科, 河南 安陽 455000)

      目的探討依那西普(ETN)對膠原誘導大鼠類風濕性關節(jié)炎(CIA)的緩解作用及其機制。方法實驗動物分為3組(n=10):①對照組;②生理鹽水治療組(NS組);③(0.5 mg/kg)依那西普治療組(ETN組)。其中②和③組的鼠在炎癥分值達到兩分及以上時隨機分組開始治療。藥物采用皮下注射牛Ⅱ型膠原誘導Wistar大鼠建立類風濕性關節(jié)炎模型。治療前和治療期間每周測量足趾容積和體重,治療4周后處死,ELISA檢測血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平;取足趾部位肌肉提取胞漿和胞核蛋白,Western blot檢測NF-κB含量及其亞細胞定位。結(jié)果依那西普治療組較之生理鹽水治療組能顯著緩解類風濕性關節(jié)炎癥癥狀、降低TNFα以及下游炎癥因子水平(P<0.05);能抑制炎癥狀況下NF-κB的核內(nèi)定位增加、胞漿定位減少的狀況。結(jié)論依那西普可通過抑制TNFα/NF-κB信號通路緩解大鼠類風濕性關節(jié)炎。

      依那西普;類風濕性關節(jié)炎;TNFα/NF-κB信號通路;大鼠

      類風濕性關節(jié)炎作為一種自身免疫病,其發(fā)病率及致殘率均較高,近年來國內(nèi)外學者對其發(fā)病機制及治療的研究均取得了較大的進展,目前認為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α)直接參與了類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)關節(jié)及關節(jié)軟骨的炎癥及破壞,NF-κB是RA進展中滑膜炎癥的重要炎性細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路,依那西普(etanercept,ETN)作為TNFα拮抗劑,通過阻止TNFα與細胞表面的受體結(jié)合,減少組織的損傷,以干擾炎癥的發(fā)生并緩解類風濕性關節(jié)炎等疾病,已廣泛應用于臨床。本文通過膠原誘導建立類風濕性關節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠模型,研究ETN對TNF-α/NF-κB信號通路的影響,以期對ETN緩解炎癥的作用機制有進一步的了解。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物與試劑

      6~7周齡雄性Wistar大鼠,由北京維通利華公司提供,合格證號SCXK(京)2012-0001,體重(170 g±10 g)。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級動物房,自由飲水進食,室溫24℃±2℃。藥物:依那西普(Etanercept,恩利),批號S20130019,由輝瑞制藥有限公司提供。試劑:牛Ⅱ型膠原蛋白,Chondrex公司;弗氏完全佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA),美國Sigma公司;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、亞細胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒(AR0106),博士德公司;大鼠血管生成素Ang-1 ELISA檢測試劑盒(XY-7338),eBioscience公司;NF-κB一抗(ab7971, 1:400)、β-actin一抗(ab6276, 1∶10 000),Abcam公司;TATA-binding protein (TBP)一抗(#12578, 1∶1 000),Cell signaling公司;辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(SA00001-2, 1∶5 000),Proteintech公司,聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,Millipore公司。

      1.2 類風濕性關節(jié)炎模型建立

      將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的牛Ⅱ型膠原蛋白與等體積的CFA充分乳化,配成終濃度為0.5 g/L的Ⅱ型膠原乳劑。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后,模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液,總量為1 ml,1周后按上述方法、相同劑量再進行1次,對照組注射等體積生理鹽水。第15天開始,大鼠出現(xiàn)關節(jié)紅腫,發(fā)病時間在15~20 d內(nèi),第21天統(tǒng)計發(fā)病情況,選取類風濕性關節(jié)炎指數(shù)≥2分的大鼠20只,與注射生理鹽水的對照組大鼠10只同時進行后續(xù)實驗。

      1.3 動物分組與處理方法

      將建模時注射生理鹽水的對照組大鼠標記為正常對照組;將建模成功的類風濕性關節(jié)炎大鼠隨機分為兩組(n=10):生理鹽水治療組(NS組)和依那西普治療組(ETN組)。NS組大鼠每天注射等體積生理鹽水;給予ETN組大鼠每天尾靜脈注射依那西普0.5 mg/kg,治療4周后處死。

      1.4 觀察與檢測指標

      (1)一般觀察:觀察大鼠體毛的色澤、活動狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測定大鼠體重。(2)類風濕性關節(jié)炎指數(shù):根據(jù)關節(jié)腫脹、顏色及關節(jié)活動情況記錄并評價大鼠全身關節(jié)病變程度,每3 d評定1次,共評定7次。評分標準:0分,無紅腫;1分,小趾關節(jié)稍腫;2分,趾關節(jié)和足趾腫脹;3分,踝關節(jié)以下的足爪腫脹;4分,包括踝關節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹,4只肢體的病變程度累積積分為類風濕性關節(jié)炎指數(shù),最高為16分。21 d后根據(jù)類風濕性關節(jié)炎指數(shù)評分≥2分選取造模成功鼠20只。(3)足趾容積的測定:根據(jù)排水法原理,用自制的關節(jié)容積測量器測量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積,從治療開始,記為第0周,每周測量1次,共5次。(4)血清炎癥因子檢測:治療4周,眼內(nèi)眥靜脈叢取血2 ml,4 000 r/min離心15 min,吸取上層血清,依照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8含量。(5)免疫印跡法(Western blot)測定足趾部位蛋白NF-κB的亞細胞結(jié)構(gòu)定位以及半定量分析,核蛋白以TBP為內(nèi)參,胞漿蛋白以β-actin為內(nèi)參。收取足趾部位肌肉樣本,根據(jù)柏世德亞細胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒說明書,提取胞漿蛋白和核蛋白。30 mg/孔的上樣量,12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。20 mA 1 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h。

      1.5 統(tǒng)計學處理

      2 結(jié)果

      2.1 三組大鼠的體重比較

      生理鹽水治療組大鼠體重在治療第0、1、2、3、4周明顯低于正常對照組(P<0.05);依那西普治療組大鼠體重在治療第4周明顯高于生理鹽水治療組(P<0.05,表1)。

      2.2 三組大鼠足趾容積比較

      生理鹽水治療組大鼠足趾容積在治療第0、1、2、3、4周明顯高于正常對照組(P<0.05);依那西普治療組大鼠足趾容積在治療第2、3、4周明顯低于治療生理鹽水治療組(P<0.05, 表2)。

      2.3 三組大鼠血清炎癥因子水平的比較

      治療4周后,生理鹽水治療組大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著高于正常對照組 (P<0.05);依那西普治療組大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著低于生理鹽水治療組(P<0.05, 表3)。

      Tab. 1 The body weight of different groups during CIA treatment (g, ±s, n=10)

      CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

      *P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNS group

      Tab. 2 The tone volume of different groups during CIA treatment(g, ±s, n=10)

      CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

      *P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNS-treated CIA group

      Tab. 3 The serum levels of TNF-α, Ang-1, IL-1β, IL-6 and IL-8 tested by ELISA (pg/ml,±s, n=10)

      TNF-α: Tumor necrosis factor α; Ang-1: Angiopoietin-1; IL-1β: Interleukin 1 beta; IL-6: Interleukin 6; IL-8: Interleukin 8

      *P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsNS-treated CIA group

      2.4三組大鼠足趾部位NF-κB蛋白表達和定位的比較

      外源物種膠原蛋白刺激產(chǎn)生的CIA狀態(tài)下,鼠足趾組織內(nèi)NF-κB p105/p50在核內(nèi)的定位異常增高(P<0.05,圖1),胞漿定位顯著低于正常對照組(P<0.05),治療4周后,治療2組NF-κB p105/p50的異常定位顯著低于治療1組(P<0.05),核內(nèi)定位的顯著降低(P<0.05),而胞漿定位顯著增加(P<0.05)。

      Fig.1Western blot of NF-κB 1: Control group; 2: NS group; 3: ETN group; NF-κB: Nuclear factor-kappa B; TBP: TATA-binding protein

      3 討論

      TNF-α在炎癥反應中起重要作用,可活化炎癥細胞,促其分泌趨化因子和黏附分子,是炎性反應中的關鍵一環(huán)。TNF-α是一種具有多種生物活性的促炎因子。在生理情況下,腸道細胞自身分泌的和腸道黏膜淋巴細胞分泌的TNF-α作用于臨近的腸道細胞,組成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng),調(diào)節(jié)腸道細胞的增殖和凋亡,對維持腸道屏障起重要作用;在病理情況下,腸道黏膜中多種炎性細胞均可大量分泌TNF-α,在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中具有重要作用。TNF-α的表達主要受NF-κB調(diào)控,后者為一類核內(nèi)的炎性轉(zhuǎn)錄因子家族,精密地調(diào)控著炎性反應和凋亡信號。黃循銣等[1]采用葡聚糖硫酸鈉定量灌胃誘發(fā)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,測定小鼠結(jié)腸通透性,并初步探討其與炎癥因子TNF-α和NF-κB p65的關系。Matsuno等[2]通過動物模型發(fā)現(xiàn)TNF-α在RA滑膜炎的發(fā)生中起關鍵作用,TNF-α可激活多形核細胞,刺激滑膜細胞產(chǎn)生前列腺素,并且通過刺激成骨細胞釋放Ca2+,抑制堿磷酶和膠原合成造成骨和軟骨破壞。NF-κB信號通路是聯(lián)系細胞因子、炎癥反應的橋梁,多種炎癥相關疾病與NF-κB 信號通路的過度激活有關,如類風濕性關節(jié)炎/干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[3、4]。靜息狀態(tài)下, NF-κB 與其抑制蛋白IκB(inhiborkbinding,IκB)以非活性的形式存在于胞漿中,當細胞受到炎性因子如TNF-α刺激時, IκB激酶復合物 IKKs被激活,使IκB經(jīng)快速磷酸化、泛素化后降解,暴露出NF-κB的 DNA 結(jié)合域,NF-κB發(fā)生核移位并與相應靶基因上特定κB序列結(jié)合,參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,發(fā)揮其相關功能[5、6],本研究發(fā)現(xiàn)CIA大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著高于正常對照組,NF-κB也呈現(xiàn)大量活化,并且表現(xiàn)出明顯的類風濕性關節(jié)炎癥,進一步證實TNF-α在類風濕性關節(jié)炎患者體內(nèi)過度表達,并激活NF-κB信號通路,參與RA疾病的發(fā)生。依那西普是二聚體融合蛋白,包含可溶性75 kD的腫瘤壞死因子受體Ⅱ(p75-TNFR或TNFR Ⅱ)的細胞外配體結(jié)合部分,以及人免疫球蛋白IgG的Fc部分,應用于類風濕性關節(jié)炎治療方面已獲得廣泛地使用和認可[7],本研究通過觀察,證實依那西普治療CIA 4周后,血清炎癥因子水平較生理鹽水治療組有顯著下降;通過對模型鼠的組織樣本進行免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),依那西普顯著改變了TNF-α下游信號分子NF-κB的亞細胞定位。本文通過NF-κB p105/p50抗體檢測胞漿和胞核中NF-κB的含量,反映其活性。本研究證實,依那西普特異拮抗TNF-α后,NF-κB p105/p50在核內(nèi)的定位顯著低于生理鹽水治療CIA組,緩解了CIA模型鼠由于外物種膠原蛋白刺激產(chǎn)生的NF-κB p105/p50核內(nèi)定位的異常增加,而胞漿蛋白的數(shù)據(jù)與此呼應,CIA模型鼠體內(nèi),NF-κB p105/p50胞漿內(nèi)含量顯著低于正常對照組,依那西普處理4周后,NF-κB p105/p50胞漿含量顯著升高。結(jié)合血清ELISA檢測結(jié)果,可以初步認識到,依那西普通過拮抗TNF-α,降低NF-κB活性,進一步阻止下游Ang-1、IL-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子的釋放,緩解類風濕性關節(jié)炎癥進展。

      綜上所述,本研究證實依那西普通過抑制TNFα/NF-κB信號通路緩解大鼠類風濕性關節(jié)炎,近年來,對依那西普的應用范圍、機制的問題,國內(nèi)外學者[8-12]都進行了廣泛研究。在個性化治療和聯(lián)合用藥[13]的趨勢下,本文從依那西普治療類風濕性關節(jié)炎的作用機制為研究點,為臨床聯(lián)合用藥提供有價值的參考。

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      EffectsofTNF-alpha/NF-kappaBsignalingpathwayonetanerceptalleviatingrheumatoidarthritis

      LIU Cai-li, WANG Ying-ying△

      (Department of Clinical Laboratory the Maternal and Child Health Hospital of Anyang City, Anyang 455000, China)

      Objective: To investigate the effects of etanercept on collagen induced arthritis rats.MethodsThe rheumatoid arthritis model was establishedviasubcutaneous injection of bovine type Ⅱ collagen, and the effects of etanercept was compared through three groups: ①the normal control;②arthritis model treated with saline;③arthritis model treated with etanercept (0.5 mg/kg, intraperitoneal injection) with 10 rats in each group;group②and group③ were selected by arthritis index (≥2)and grouped randomly. The body weight and toe volume were measured at just before and during treatment weekly. Rats were sacrificed after 4 weeks of treatment, and the serum levels of tumor necrosis factor α(TNF-α), angiopoietin-1(Ang-1), IL-1β, IL-6 and IL-8 were tested by ELISA. Nuclear factor-kappa B(NF-κB) levels and subcellular locations in toe muscles were test by Western blot.ResultsEtanercept significantly relieved inflammation of rheumatoid arthritis, lowered the TNF-α and relative inflammatory factors levels compared with saline treatment (P<0.05). The results of Western blot showed that etanercept significantly suppressed the nuclear location of NF-κB p105/p50 caused by inflammation.ConclusionThe anti-inflammatation effect of etanercept may be related to its activity in inhibiting the activation of TNF-α/NF-κB pathway.

      etanercept; rheumatoid arthritis; TNF-α/NF-κB pathway; rats

      R593.22

      A

      1000-6834(2017)04-373-04

      2017-02-23

      2017-06-05

      Tel: 13569067892; E-mail: 10485536@qq.com

      10.12047/j.cjap.5569.2017.090

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