南極德雷克海峽表層海水酵母菌多樣性研究

李昭 王偉 郝建華 孫謐

摘 要：為了研究德雷克海峽的微生物多樣性，采集南極德雷克海峽表層海水，通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法獲得可培養(yǎng)的酵母菌株，對(duì)其18S rDNA保守序列進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果表明：共分離出45株酵母菌，屬于9個(gè)屬，12個(gè)種；其中，優(yōu)勢(shì)屬為Meyerozyma屬，優(yōu)勢(shì)種為Meyerozyma guilliermondii。對(duì)所有菌株的過(guò)氧化氫酶活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)23株酵母菌具有強(qiáng)烈的過(guò)氧化氫酶活性，13株具有弱過(guò)氧化氫酶活性，即可分解過(guò)氧化氫的菌株占總菌株數(shù)的80%。

關(guān)鍵詞：可培養(yǎng)酵母菌；18S rDNA；過(guò)氧化氫酶

中圖分類(lèi)號(hào)：Q938.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2017）01-0068-05

Abstract：In order to study microbial diversity in the surface seawater of the Drake Passage in Antarctic， 7 surface seawater samples were collected to isolate the strains of culturable yeast by the traditional method， and 18S rDNA sequencing and phylogenetic analyses were carried out. The results showed that 45 yeast strains were isolated and there were 9 genera and 12 species. Meyerozyma sp. and Meyerozyma guilliermondii was the dominant genera and species. The results of the catalase activities showed that 23 strains were strong catalase positive， 13 strains were weak， and 80% strains were catalase positive.

Key words：culturable yeast； 18S rDNA； catalase

德雷克海峽是世界上最寬的海峽，位于南美南部的火地島和南極半島之間，是溝通太平洋和大西洋水體的唯一通道[1]。在對(duì)環(huán)南極所有海域表層海水葉綠素a和初級(jí)生產(chǎn)力的研究中發(fā)現(xiàn)，德雷克海峽表層海水的葉綠素a含量和初級(jí)生產(chǎn)力均最低[2]。在南極水域的4個(gè)海區(qū)中，德雷克海峽的硅含量（Si/P僅3.34）和顆粒有機(jī)碳（POC）濃度（<100 pg/dm3）也是最低的。這些都可能成為微生物生長(zhǎng)的限制因子[3]。目前，關(guān)于德雷克海峽微生物多樣性的研究報(bào)道較少。

過(guò)氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，產(chǎn)生于生物代謝過(guò)程的氧化還原反應(yīng)，它可以輕易的穿過(guò)細(xì)胞壁或質(zhì)膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并通過(guò)氧化蛋白質(zhì)的巰基和斷裂核酸單鏈而傷害到組織或細(xì)胞的任一部位[4]。生活在有氧環(huán)境中的生物通常都有可以專(zhuān)門(mén)消除過(guò)氧化氫的生物抗氧化保護(hù)劑——過(guò)氧化氫酶，該酶具有較高的催化效率，可確保過(guò)氧化氫被迅速分解而不損傷有機(jī)體[5]。因此，在生物演化過(guò)程中該酶逐漸成為生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一[6-8]。

1 材料與方法

1.1 采樣位置及樣品處理

試驗(yàn)所用樣品取自南極德雷克海峽表層海水，采樣時(shí)間為2012年3月。共收集7個(gè)站點(diǎn)的表層海水樣品（圖1），其中44#、34#、5# 和15#號(hào)站點(diǎn)位于采樣區(qū)域的邊緣，49#號(hào)站點(diǎn)位于采樣區(qū)域的中心位置，6#號(hào)為5#的對(duì)比站點(diǎn)，42#號(hào)為49#號(hào)的對(duì)比站點(diǎn)，這樣的采樣區(qū)設(shè)置使得試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。取樣后2 h內(nèi)在無(wú)菌操作室中將樣品抽濾過(guò)0.2 μm微孔濾膜，將濾膜置于無(wú)菌的4 mL離心管中，加入甘油后于-80℃保存[9]。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)、純化及保種

在無(wú)菌條件下，用2 mL滅菌海水反復(fù)沖洗濾膜并渦旋，分別取200 μL涂布于海水R2A培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基和海水瓊脂培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基涂布2個(gè)平板，分別置于4、16和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出可辨認(rèn)的菌落。根據(jù)菌落形態(tài)挑取不同

單菌落，進(jìn)行劃線(xiàn)純化，純化3次后接種于斜面，用15%的甘油保種液洗脫菌苔，-80℃保藏。

1.3 菌株基因組DNA的提取

將菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板，在28℃活化培養(yǎng)48 h。用TE緩沖液洗脫菌體，利用酚-氯仿法[10]提取菌株的基因組DNA。

1.4 18S rDNA擴(kuò)增

酵母菌18S rDNA通用引物[11]：上游引物P1：5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；下游引物P2：5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACC'。PCR退火溫度為52～55℃。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化。

1.5 18S rDNA序列測(cè)定及構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)

將所得菌株的18S rDNA 基因PCR產(chǎn)物送北京六合華大生物公司進(jìn)行測(cè)序，出現(xiàn)雜合的樣品進(jìn)行克

隆[10]后再測(cè)序。將所得的18S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)后，選取與分離菌株相似度最高的種作為標(biāo)準(zhǔn)株，用MEGA 5.0 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用自舉法（Bootstrap method）使用1 000次自展測(cè)試進(jìn)化樹(shù)的可靠性。

將所有菌株的18S rDNA 序列提交至GenBank，獲得的序列號(hào)為KR336835-KR336846。

1.6 降解過(guò)氧化氫（H2O2）

對(duì)所有菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性檢測(cè)[12]，陽(yáng)性的為具有降解H2O2能力的菌株，陰性的則不能降解H2O2。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的選取、DNA的提取和PCR擴(kuò)增

待海水R2A培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基和海水瓊脂培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落特征、菌絲、孢子等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，共挑取菌株45株，其中5#號(hào)站點(diǎn)2株，6#號(hào)站點(diǎn)7株，15#號(hào)站點(diǎn)5株，34#號(hào)站點(diǎn)10株，42#號(hào)站點(diǎn)4株，49#號(hào)站點(diǎn)9株，44#號(hào)站點(diǎn)8株。

提取菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增18S rDNA基因后電泳，均能得到長(zhǎng)度約為1.8 kb的單一條帶。

2.2 可培養(yǎng)菌株的鑒定

BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示，分離所得的45株酵母菌中，共包含了9個(gè)屬，12個(gè)種（表1）。優(yōu)勢(shì)屬為Meyerozyma屬（季也蒙酵母屬），占總菌株數(shù)的40%；其他8個(gè)屬分別為Rhodosporidium屬（紅冬孢酵母屬）、Candida屬（假絲酵母屬）、Rhodotorula屬

（紅酵母屬）、Cryptococcus屬（隱球酵母屬）、Trichosporon屬（絲孢酵母屬）、Leucosporidium屬、Debaryomyces屬（德巴利氏酵母屬）和Cystofilobasidium屬（圖2）。優(yōu)勢(shì)種為Meyerozyma guilliermondii，占總菌株數(shù)的40%；其他11個(gè)種分別為T(mén)richosporon pullulans （茁芽絲孢酵母菌）、Rhodotorula glutinis （粘紅酵母菌）、Leucosporidium scottii、Cryptococcus peneaus、Cryptococcus psychrotolerans、Candida austromarina、Candida zeylanoides （涎沫假絲酵母菌）、Candida membranifaciens （璞膜假絲酵母菌）、Debaryomyces hansenii （漢遜德巴利氏酵母菌）、Cystofilobasidium infirmominiatum和Rhodosporidium diobovatum（圖3）。

2.3 可培養(yǎng)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由圖可知4，Debaryomyces屬（德巴利氏酵母

（Nc49HB-1類(lèi)：Nc49HB-1/ Nb15MB-1/ Na6RA-1/ Nb6HB-1/ Nb6MA-1/ Na34RB-1/ Na34HA-1/ Na34HA-2/ Nb34MB-1/ Nb44HA-1/ Na49RB-1/ Na49MB-1/ Na5HA-1/ Na5RB-1/ Nc44RA-1/ Nc44RB-2/ Nc44MA-1/ Nc44HB-1，共18個(gè)菌株； Nc42MB-2類(lèi)：Nc42MB-2/ Nc6HA-2/ Nc6HB-2，共3個(gè)菌株； Nc15MB-3類(lèi)：Nc15MB-3/ Nb34RB-3/ Nc34RB-2/ Nc34MA-3，共4個(gè)菌株； Na49MA-1類(lèi)：Na49MA-1/ Na49MB-3/ Nc44RA-3/ Nc44MB-3/ Nb49MA-3/ Nb49MB-3，共3個(gè)菌株。）

（假絲酵母屬）處于同一進(jìn)化分枝，Trichosporon屬（毛孢子菌屬）、Cystofilobasidium屬和Cryptococcus屬（隱球酵母屬）處于同一進(jìn)化分枝，Leucosporidium屬（白冬孢酵母屬）、Rhodotorula屬（紅酵母屬）和（紅冬孢酵母屬）處于同一進(jìn)化分枝。Candida屬（假絲酵母屬）的3個(gè)種處于同一進(jìn)化分枝，Cryptococcus屬（隱球酵母屬）的2個(gè)種也處于同一進(jìn)化分枝。

2.4 降解過(guò)氧化氫（H2O2）

對(duì)獲得的45菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性檢測(cè)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，45株真菌菌株中，23株具有強(qiáng)烈的過(guò)氧化氫酶活性（+），占總菌株數(shù)的51%；13株具有弱過(guò)氧化氫酶活性（W），占總菌株數(shù)的29%；9株沒(méi)有過(guò)氧化氫酶活性，占總菌株數(shù)的20%。12個(gè)種中有11個(gè)種都有不同程度的過(guò)氧化氫酶活性，只有璞膜假絲酵母菌（Candida membranifaciens）種沒(méi)有菌株有過(guò)氧化氫酶活性。

3 討 論

采用可培養(yǎng)的方法對(duì)采自南極德雷克海峽7個(gè)站點(diǎn)的表層海水樣品中酵母菌種類(lèi)和多樣性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，7個(gè)樣品中共分離出酵母菌45株，分別屬于9個(gè)屬，12個(gè)種。

至今為止，從南極土壤、海水、空氣等樣品中所獲得的酵母菌多為Penicillium屬（青霉屬）、Cladosporium屬（枝孢霉屬）、Chrysosporium屬（金孢霉屬）、Aspergillus屬（曲霉屬）、Candida屬（假絲酵母屬）、Rhodotorula屬（紅酵母屬）、Geomyces屬（地絲霉屬）、Metschnikowia屬（梅奇酵母屬）、Cryptococcus屬（隱球酵母屬）等，另外還包括Streptomyces屬（鏈霉菌屬）、Torulopsis屬（球擬酵母屬）、Cephalosporium屬（頭孢霉屬）、Eurolium屬（散子囊菌屬）、Meyerozyma屬（季也蒙酵母屬）、Leucosporidium屬（白冬孢酵母屬）、Rhodosporidium屬（紅冬孢酵母屬）、Cystofilobasidium屬等[13-21]。該試驗(yàn)所獲得的大多數(shù)種屬在南極其他地區(qū)也曾發(fā)現(xiàn)過(guò)[15，18-19，21]，但Trichosporon屬（毛孢子菌屬）和Debaryomyces屬（德巴利氏酵母屬）卻鮮有發(fā)現(xiàn)。

在優(yōu)勢(shì)菌群方面，試驗(yàn)中優(yōu)勢(shì)屬為Meyerozyma屬

（季也蒙酵母屬），優(yōu)勢(shì)種為Meyerozyma guilliermondii，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道也并不相同，原因可能是因?yàn)樯鲜鑫墨I(xiàn)大多采用營(yíng)養(yǎng)較為豐富的土豆培養(yǎng)基（PDA），且采用較低溫度培養(yǎng)（多為4～20℃），而該試驗(yàn)采用了3種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，以及3個(gè)不同梯度的培養(yǎng)溫度，在模擬南極表層海水低溫、寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的同時(shí)，盡量提供多種不同的培養(yǎng)環(huán)境，以期得到更多不同類(lèi)型的菌株，使得研究結(jié)果更加可信。該試驗(yàn)中優(yōu)勢(shì)種Meyerozyma guilliermondii占到總菌株數(shù)的40%，且在3種培養(yǎng)基、3種培養(yǎng)溫度下都能得到，這些都從側(cè)面

反映出Meyerozyma guilliermondii適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)。

表層海水中溶解的有機(jī)碳受到紫外線(xiàn)的光化學(xué)激活作用從而產(chǎn)生過(guò)氧化氫[22-25]，由于大氣中的臭氧層“空洞” 南極地區(qū)紫外輻射較強(qiáng)烈，因此南極地區(qū)表層海水中必然富集了大量的過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫是一種活性氧化劑，具有細(xì)胞毒性，可以引發(fā)海洋微生物的氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]，導(dǎo)致微生物中的膜脂[27-28]、蛋白質(zhì)[29]、核酸[30]等的氧化性損傷，從而擾亂細(xì)胞膜的運(yùn)輸[31-33]，妨礙細(xì)胞的穩(wěn)定性[25，34-35]。由此推測(cè)，南極海水中的微生物必然可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，以抵抗過(guò)氧化氫對(duì)于微生物的毒害。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，南極德雷克海峽可培養(yǎng)酵母菌中具有過(guò)氧化氫酶活性的比例非常高，達(dá)到總菌株數(shù)的80%，也印證了這一推測(cè)。過(guò)氧化氫酶除了能夠幫助微生物抵抗過(guò)氧化氫的毒害之外，在人類(lèi)的生產(chǎn)中也有著廣泛的應(yīng)用。例如：在食品工業(yè)中，牛奶或液體雞蛋制品通常使用過(guò)氧化氫來(lái)消毒， 而過(guò)氧化氫酶可以去除殘余的過(guò)氧化氫；在環(huán)保行業(yè)中，用過(guò)氧化氫酶取代化學(xué)試劑降解工業(yè)廢水中含有的過(guò)氧化氫，避免二次污染， 同時(shí)也可以降解芳環(huán)化合物和脂族化合物。

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（責(zé)任編輯：成 平）