不同年齡哈薩克羊卵巢卵泡分布及組織學(xué)特征

彭宏剛

摘要：哈薩克羊作為中國三大粗毛羊品種之一，是我國寶貴的畜禽遺傳資源之一，研究不同年齡哈薩克羊卵巢中卵泡的分布及各級卵泡形態(tài)學(xué)特征，可為進(jìn)一步開展其卵巢基礎(chǔ)生理研究和品種遺傳資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。試驗采用組織學(xué)方法，分別對胎兒、羔羊、青年母羊、老齡母羊卵巢切片進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同年齡哈薩克羊卵泡分布區(qū)域相異，胎兒卵巢組織中以原始卵泡為主，主要分布于皮質(zhì)最外層，內(nèi)含較大的卵母細(xì)胞核。羔羊卵巢組織中發(fā)育卵泡較少；青年母羊發(fā)育卵泡則較多，主要分布于與髓質(zhì)交界的區(qū)域。發(fā)育卵泡外周常環(huán)繞單層或多層立方狀顆粒細(xì)胞。隨著年齡增長，老齡母羊中逐漸以閉鎖卵泡為主，哈薩克羊閉鎖卵泡卵母細(xì)胞皺褶，核固縮或顆粒細(xì)胞分布雜亂與基底膜分離。

關(guān)鍵詞：哈薩克羊；卵巢；卵泡；分布；組織學(xué)特征

中圖分類號：S813；S826 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）010-0005-02

哺乳動物卵巢內(nèi)含有數(shù)量龐大的腔前卵泡，然而在生理條件下，這些卵泡只有不到1%能發(fā)育到成熟排卵階段，其余都由于閉鎖而退化，這是對雌性繁殖潛力的極大浪費(fèi)。哈薩克羊是新疆原產(chǎn)的中國三大粗毛羊品種之一，肉脂兼用，具有較高的肉脂生產(chǎn)性能。哈薩克羊是我國寶貴的畜禽遺傳資源之一，作為母系品種參與了新疆細(xì)毛羊和中國卡拉庫爾羊品種的培育。研究表明，卵巢所處的年齡、發(fā)情周期等的不同會影響卵泡對外界激素的敏感性，卵巢內(nèi)各級卵泡的構(gòu)成也會隨著年齡的變化而發(fā)生改變。本研究旨在對比不同年齡哈薩克羊個體卵巢中卵泡的分布與各級卵泡組織學(xué)特征，為進(jìn)一步開展卵巢基礎(chǔ)生理研究和品種遺傳資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 卵巢組織的采集與處理 不同年齡階段雌性哈薩克羊卵巢包括三月齡胎兒、3～6月齡羔羊、1～3歲青年母羊以及老齡母羊（5歲以上）從當(dāng)?shù)赝涝讏霾杉?，保存?7～32 ℃添加有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的生理鹽水或PBS緩沖液中，1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室。在體視顯微鏡下，去除卵巢附屬物，十字剖分成1～2 mm3大小的組織塊用4%多聚甲醛PBS液固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 組織切片機(jī)、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、眼科手術(shù)刀、手術(shù)剪和35 cm培養(yǎng)皿。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水，PBS液，蘇木素-依紅染液， 4%多聚甲醛-PBS液。

1.1.4 主要溶液的配置

（1）蘇木素-依紅染液。蘇木精染液配方（20×）：蘇木精0.5 g，銨汞24 g，水50 mL，NaIO3 0.5 g，甘油30 mL，冰醋酸2 mL（細(xì)胞核染色，堿性），用時20倍稀釋。1%伊紅染液配方：1 g伊紅溶于100 mL蒸餾水中。

（2）無鈣鎂PBS溶液。KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.88 g，Mill-Q超純水定容到1 L，pH 7.0～7.4，用0.22 μm濾膜過濾滅菌后4 ℃保存。

（3）4%多聚甲醛-PBS溶液。4 g多聚甲醛，溶于100 mL PBS液中4 ℃保存。

1.2 試驗設(shè)計

本研究旨在分析不同年齡哈薩克羊卵巢中卵泡的分布與組織學(xué)特征。樣本采集時左右卵巢分別對應(yīng)編號，固定后用常規(guī)組織學(xué)方法對比不同年齡階段哈薩克羊卵巢組織中卵泡的分布，以及不同發(fā)育階段卵泡的組織學(xué)特征。

1.3 組織切片與染色

卵巢組織塊固定后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，10 μm連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察。卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，分為原始卵泡和發(fā)育卵泡（過渡卵泡，初級卵泡和次級卵泡）。形態(tài)正常卵泡具有完整的卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞排列規(guī)則，無固縮細(xì)胞核，異常卵泡卵母細(xì)胞皺褶或顆粒細(xì)胞分布雜亂與基底膜分離，核固縮。

卵泡密度的衡量：本研究采用平均每張切片上的卵泡數(shù)量作為卵泡密度。

各級卵泡構(gòu)成：對計數(shù)切片上隨機(jī)5個高倍視野下（×200）具有明顯卵母細(xì)胞核的健康卵泡和閉鎖卵泡分別進(jìn)行計數(shù)，對健康的各級卵泡數(shù)量分別記錄，計算卵泡比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡階段個體卵巢中卵泡的分布

卵巢組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢中腔前卵泡主要分布在皮質(zhì)部，且分布不均勻。原始卵泡處于皮質(zhì)最外層，在致密的白膜結(jié)構(gòu)下，密度較大，常聚集成團(tuán)，這種現(xiàn)象在胎兒卵巢組織中尤為明顯（圖1a）；初級和次級卵泡則分布于卵巢內(nèi)部與髓質(zhì)交界的區(qū)域，且密度較低。羔羊卵巢中發(fā)育卵泡較少（圖1b），青年母羊發(fā)育卵泡較多（圖1c），老齡母羊中閉鎖卵泡增多（圖1d）。

2.2 各級卵泡組織學(xué)特征

試驗結(jié)果表明，原始卵泡有較大的卵母細(xì)胞核，外面包裹單層的扁平顆粒細(xì)胞，數(shù)量從0～13不等。胎兒卵巢中原始卵泡與出生后原始卵泡有很大的差異，胎兒組織中原始卵泡顆粒細(xì)胞較少，且大多沒有形成卵泡樣結(jié)構(gòu)。胎兒卵泡中有時會發(fā)現(xiàn)合胞體現(xiàn)象，且基底膜不明顯，完整的基底膜原始卵泡主要發(fā)現(xiàn)于青年和老齡母羊卵巢中（圖1e）。

初級卵泡外周環(huán)繞單層立方狀或柱狀顆粒細(xì)胞，數(shù)量增多，有明顯的基底膜隔離卵泡與間質(zhì)細(xì)胞，顆粒細(xì)胞數(shù)量增多，在羔羊卵巢中常發(fā)現(xiàn)由扁平和立方狀顆粒細(xì)胞混雜的過渡性初級卵泡（圖1f）。

次級卵泡外周環(huán)繞2～7層立方狀顆粒細(xì)胞，基底膜明顯，具有完整的卵泡結(jié)構(gòu)和透明帶。顆粒細(xì)胞數(shù)量急劇增加，數(shù)量從幾十到數(shù)百不等（圖1c）。

閉鎖卵泡通常表現(xiàn)為兩種特征（圖1g，圖1h），卵母細(xì)胞皺褶，核固縮或顆粒細(xì)胞分布雜亂與基底膜分離。但是因為胎兒卵巢組織中多為原始卵泡階段，且含有較多的卵原細(xì)胞，因此閉鎖的卵泡在組織學(xué)下較難辨認(rèn)。endprint

3 小結(jié)與討論

從試驗結(jié)果可知，綿羊卵巢中從胎兒時期開始就含有大量的原始卵泡，隨著年齡的增長，卵泡數(shù)量不斷減少。而伴隨著這一數(shù)量減少的過程，卵泡發(fā)育不斷啟動，原始卵泡顆粒細(xì)胞層增殖，形狀由扁平轉(zhuǎn)變?yōu)橹鶢罨蛄⒎綘睿優(yōu)閱螌踊蚨鄬拥陌l(fā)育卵泡，直至竇腔排卵階段。但實(shí)際上最終發(fā)育到成熟階段的卵泡相對卵泡總數(shù)而言數(shù)量是很小的，這一現(xiàn)象說明卵泡發(fā)育過程中大部分的卵泡發(fā)生閉鎖，這應(yīng)該與優(yōu)勢卵泡的形成機(jī)制有關(guān)[1]。

原始卵泡多位于皮質(zhì)淺層，緊靠白膜，且密度較大，通常沒有血管存在。而發(fā)育卵泡主要位于皮質(zhì)的中層和內(nèi)層，且發(fā)育程度越高，位置越靠近卵巢內(nèi)部。多層顆粒細(xì)胞的次級卵泡位于皮質(zhì)與髓質(zhì)交界的區(qū)域，這些區(qū)域血管較多，結(jié)構(gòu)相對松散。上述觀察結(jié)果與其他關(guān)于家羊的報道基本一致[2]。哈薩克羊卵泡的這種分布規(guī)律表明卵泡的發(fā)育需要血管體系提供必要的激素和生長因子的刺激以及能量支持。卵巢中大部分原始卵泡都處于相對靜止的休眠狀態(tài)，可能與能量供給較少有關(guān)。陳大元[3]的研究結(jié)果表明發(fā)育卵泡需求的能量供給除供卵泡自身生長所需外，還可能累積和儲存在卵子中，為將來的胚胎早期發(fā)育提供必需的能量和DNA蛋白質(zhì)的合成底物。

總之，本試驗結(jié)果表明，哈薩克羊卵巢中原始卵泡位于皮質(zhì)的最外層，緊靠白膜下方，密度較大，而發(fā)育卵泡位于皮質(zhì)里層。青年母羊卵巢內(nèi)發(fā)育程度較高，卵泡可能對外界因子敏感，同時材料易于從屠宰場獲得，可以作為卵巢生理基礎(chǔ)研究試驗的材料來源。而胎兒和羔羊卵巢中原始卵泡數(shù)量較多，且構(gòu)成相對單一，是研究原始卵泡發(fā)育進(jìn)程的理想材料。

參考文獻(xiàn)：

[1] NANDI S，GIRISH KUMAR V，RAMESH H S，et al. Isolation and culture of ovine and bubaline small and large pre-antral follicles：effect of cyclicity and presence of a dominant follicle[J].Reprod Domest Anim，2009，44：74-79.

[2] ISLAM M R，KHANDOKER M A，AFROZ S，et al. Qualitative and quantitative analysis of goat ovaries，follicles and oocytes in view of in vitro production of embryos[J].J Zhejiang Univ Sci B，2007，8（7）：465-469.

[3] 陳大元.受精生物學(xué)：受精機(jī)制與生殖工程[M].北京：科學(xué)出版社，2003.endprint