李慧娟　潘思皓　杜函圳

摘要：為了解川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）阿魏酸生物合成相關(guān)基因的密碼子使用偏好性特點(diǎn)，為運(yùn)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)阿魏酸的異源生物合成提供理論依據(jù)，對(duì)川芎轉(zhuǎn)錄組中共50 108條Unigenes使用CodonW、Cusp和Chips進(jìn)行在線分析。結(jié)果表明，總GC含量為41.4%，有效密碼子占總數(shù)的16.17%，最優(yōu)密碼子偏好以A/U結(jié)尾，表明川芎轉(zhuǎn)錄組Unigenes密碼子偏好程度整體水平不高。比較分析了川芎轉(zhuǎn)錄組中阿魏酸生物合成相關(guān)基因（PAL、C4H、C3H與COMT）與不同模式生物的稀有密碼子，表明與大腸桿菌基因組密碼子使用頻率差值較大的有4個(gè)，與酵母、煙草和擬南芥基因組差值較大的均有3個(gè)，這預(yù)示著川芎阿魏酸生物合成相關(guān)基因在酵母、煙草和擬南芥中的表達(dá)效率較高。

關(guān)鍵詞：川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）；阿魏酸；生物合成相關(guān)基因；密碼子偏好性分析

中圖分類號(hào)：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3549-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.040

Abstract： In order to understand the codon usage preference of genes involved in the biosynthesis of ferulic acid in Ligusticum chuanxiong Hort.，and thereby providing a theoretical basis for the application of genetic engineering technology to achieve heterologous biosynthesis of ferulic acid，50 108 unigenes of L. chuanxiong transcriptome were analyzed on-line using CodonW，Cusp and Chips at first. As a result，the total GC content was 41.4%，valid codons was 16.17% and the optimal codon preferred A/U as end. Furthermore，the rare codons of PAL，C4H，C3H and COMT were compared with those of candidate expressed hosts，including E. coli，yeast，tobacco and Arabidopsis thaliana. As a result，4 codons were found between E. coli and L. chuanxiong，and 3 codons were found among yeast，tobacco and Arabidopsis thaliana. It suggests high expressional ratio of PAL，C4H，C3H and COMT might take place in yeast，tobacco and Arabidopsis thaliana.

Key words： Ligusticum chuanxiong Hort.； ferulic acid； genes involved in biosynthesis； codon preference analysis

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，為“血中之氣藥”，有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效[1]。根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定，阿魏酸是川芎的主要指標(biāo)成分，具有獨(dú)特的藥理作用和生物活性，且毒性較低，因而在醫(yī)藥、保健品、化妝品原料和食品添加劑等領(lǐng)域有極其廣泛的應(yīng)用前景[1]。目前，阿魏酸可通過(guò)提取、化學(xué)合成、水解及微生物培養(yǎng)等4種方法獲得。提取法與化學(xué)合成法均需使用大量的化學(xué)溶劑，易污染環(huán)境；水解法需要首先提取獲得阿魏酸酯，再利用水解制備阿魏酸，也會(huì)使用大量的化學(xué)溶劑，易造成環(huán)境污染；微生物培養(yǎng)法由于阿魏酸含量很低因而分離純化成本高[2]。

植物體內(nèi)阿魏酸的生物合成以苯丙氨酸為原料，經(jīng)過(guò)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、香豆酸-3-O-羥基化酶（C3H）與咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）的有序催化，最后生成阿魏酸（Ferulic acid）（圖1）。

在通過(guò)基因工程生產(chǎn)阿魏酸的研究過(guò)程中，密碼子使用偏好性對(duì)于基因異源表達(dá)效率具有至關(guān)重要的作用。密碼子是遺傳信息從堿基序列到氨基酸序列傳遞的基本單位。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中同義密碼子并不被隨機(jī)使用，某一物種或某一基因往往傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，這種現(xiàn)象被稱為密碼子使用偏好性（Codon usage bias）。密碼子使用偏好性是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的，具有種族特異性，該現(xiàn)象常導(dǎo)致外源基因在宿主中的表達(dá)降低，因此在研究基因異源表達(dá)的時(shí)候，密碼子偏好性研究具有重要作用，使用密碼子的偏好性可利于選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)，或者通過(guò)改造密碼子來(lái)提高外源基因的表達(dá)。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室已獲得了川芎根莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共50 108條Unigenes。本研究首先對(duì)川芎轉(zhuǎn)錄組中共50 108條Unigenes使用CodonW、Cusp和Chips進(jìn)行在線分析，獲得其總GC含量、有效密碼子及最優(yōu)密碼子等信息。比較分析川芎阿魏酸生物合成相關(guān)基因（PAL、C4H、C3H與COMT）與不同候選宿主（大腸桿菌、酵母、煙草和擬南芥）的稀有密碼子比例，篩先最適宿主，為利用基因工程方法生產(chǎn)阿魏酸奠定理論基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

研究所采用的COMT基因轉(zhuǎn)錄組50 108條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄序列為前期所獲川芎根莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，該轉(zhuǎn)錄組原始Reads序列已提交NCBI，登錄號(hào)SRP043485。大腸桿菌、酵母、煙草和擬南芥基因組的密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)自于Codon Usage Databas（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。利用CodonW軟件（http：//codonw.sourceforge.net/）計(jì)算有效密碼子數(shù)（Effective number of codons，ENC）、計(jì)算CDS區(qū)的GC含量、密碼子中第3位堿基的GC含量（GC3s）和相對(duì)同義密碼子使用概率（Relative synonymous codon usage，RSCU），利用EMBOSS中的CUSP（Create a codon usage table）和CHIPS（Codon heterozygosity in a protein coding sequence）計(jì)算密碼子使用概率。

1.1 密碼子使用偏好性分析

使用CodonW軟件對(duì)川芎密碼子組成進(jìn)行分析[3-5]，然后對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算分析指標(biāo)為樣本總GC含量、樣本密碼子第3位核苷酸的GC含量（GC3）、有效密碼子數(shù)（Effective number of codons，ENC）、同義密碼子相對(duì)使用頻率（Relative synonymous codon usage，RSCU）。有效密碼子數(shù)指密碼子使用偏離隨機(jī)選擇的程度，用于反映同義密碼子非均衡使用的偏好程度；同義密碼子相對(duì)使用頻率指對(duì)于某一特定的密碼子在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)概率。

1.2 最優(yōu)密碼子分析

通過(guò)Jiang[6]的方法來(lái)計(jì)算川芎的最優(yōu)密碼子含量。選取從小到大排序的ENC數(shù)據(jù)的上限區(qū)域10%和下限區(qū)域10%的基因編碼區(qū)序列為子數(shù)據(jù)集，分別對(duì)其RSCU進(jìn)行計(jì)算和比較，如果兩者差異大于0.3，且RSCU在高表達(dá)基因子集中大于1.0，在低表達(dá)基因子集中小于1.0，則該密碼子為最優(yōu)密碼子[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC含量分析

使用CodonW對(duì)已經(jīng)獲得的川芎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行密碼子使用偏好性分析，分析結(jié)果表明，川芎中所有Unigenes的平均總GC量為41.4%，總GC含量分布范圍為13.3%～80.6%。密碼子第3位核苷酸的平均GC含量（GC3）為37.43%，平均GC3含量分布范圍為0～100%。以上分析表明，川芎密碼子第3位核苷酸無(wú)明顯偏好性，但不同基因間GC3含量分布范圍較總GC含量分布范圍大。

2.2 有效密碼子數(shù)分析

有效密碼子數(shù)ENC用于定量分析基因的密碼子使用偏好性，其值范圍一般在20～61之間，其值越小，其偏好性程度越大。該值是描述密碼子使用偏離隨機(jī)選擇的程度，并不是某個(gè)特殊密碼子的使用頻率與其他密碼子的比較，能反映密碼子中同義密碼子非均衡使用的偏好程度。川芎基因ENC的分布范圍為20～61，平均ENC為46.09。根據(jù)Wright[5]和Sharp等[8]的方法將ENC為35作為區(qū)分偏好性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，川芎基因中ENC<35的有7 742條，占總數(shù)的16.17%，ENC>35的有40 145條，占總數(shù)的83.83%。說(shuō)明川芎基因密碼子偏好程度不高，但不同基因間密碼子使用偏好性仍然存在差異。

2.3 密碼子使用頻率分析及最優(yōu)密碼子分析

同義密碼子相對(duì)使用頻率RSCU，是衡量密碼子使用偏好性的另一個(gè)指標(biāo)，如果密碼子的使用沒(méi)有偏好性，則該密碼子的RSCU=1，當(dāng)某一密碼子的RSCU>1時(shí)，代表該密碼子為使用相對(duì)較多的密碼子，反之亦然。通過(guò)對(duì)高ENC值和低ENC值的基因子集的比較和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算川芎轉(zhuǎn)錄組樣本的最優(yōu)密碼子，確定6個(gè)密碼子為川芎的最優(yōu)密碼子UUU、UUC、UUA、CCU、AGU與AGA，分別編碼Phe、Leu、Pro、Ser與Arg等5種氨基酸，其中編碼Phe的密碼子有兩個(gè)（UUU與UUC），6個(gè)最優(yōu)密碼子中，除UUC外，其余密碼子都以A/U結(jié)尾（表1）。說(shuō)明川芎最優(yōu)密碼子偏好以A/U結(jié)尾的密碼子。

2.4 基因表達(dá)的稀有密碼子分析

根據(jù)Codon Usage Database數(shù)據(jù)，B型大腸桿菌中最稀有的6個(gè)密碼子分別為UGA、UAA、AGG、CCC、CGA與AGA。酵母中最稀有的6個(gè)密碼子分別為UAG、UGA、UAA、CGG、CGC與CGA。煙草中最稀有的6個(gè)密碼子為UAG、UGA、UAA、CGG、CGC與ACG。而擬南芥中最稀有的6個(gè)密碼子為UAG、UAA、UGA、CGC、CGG與CCC。

根據(jù)CodonW分析結(jié)果，川芎50 108條Unigenes中有24個(gè)偏好性較強(qiáng)的密碼子，包括UUU、UCU、UAU、UGU、UCA、UUG、CUU、CCU、CAU、CCA、CAA、AUU、ACU、AAU、AGU、ACA、AAA、AGA、GUU、GCU、

GAU、GGU、GCA與GAA。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中有一個(gè)稀有密碼子（AGA）是川芎偏好使用的密碼子，如果需要克隆表達(dá)的川芎基因含有較多的AGA密碼子，則該基因可能會(huì)在大腸桿菌中表達(dá)困難。而酵母、煙草與擬南芥均不含有川芎偏好使用的密碼子。因此，與酵母、煙草、擬南芥相比，大腸桿菌的密碼子使用偏好性與川芎的略有差異，但差別不大。

經(jīng)過(guò)對(duì)川芎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的功能注釋，從中發(fā)現(xiàn)16條與阿魏酸生物合成相關(guān)的Unigenes，包括5條PAL、1條C4H、2條C3H與8條COMT（表2）。計(jì)算這16條Unigenes與4種不同宿主的稀有密碼子比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌分值最高，表明大腸桿菌中含有最多的稀有密碼子（圖2）。如果選擇大腸桿菌為宿主，C54052的稀有密碼子數(shù)目最多，為50；C57565次之，為27。如果以酵母為宿主，C54052的稀有密碼子數(shù)目同樣最多，為15；C57565次之，為5。如果以煙草與擬南芥為宿主，C54052含有的稀有密碼子最多，分別為11與15；C55080次之，分別為6與6（表3）。這個(gè)分析結(jié)果與前面的轉(zhuǎn)錄組總體分析結(jié)果吻合，即大腸桿菌是表達(dá)最困難的宿主，而酵母、煙草與擬南芥的表達(dá)難度相對(duì)較低。endprint

當(dāng)宿主中稀有密碼子比例偏高，在對(duì)某個(gè)具體基因表達(dá)時(shí)，可以根據(jù)密碼子偏性部分改造密碼子，來(lái)適應(yīng)大腸桿菌或酵母、煙草或擬南芥的密碼子使用偏好性，來(lái)提高表達(dá)效率。為了提升在異源體系中目的基因的表達(dá)量，可對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造，將異源體系中稀有密碼子替換為優(yōu)勢(shì)密碼子。大腸桿菌稀有密碼子為編碼TER的UGA、UAA，編碼Met的AGG，編碼Arg的CCC、AGA，編碼Gln的CGA。酵母的稀有密碼子為編碼TER的UAG、UGA、UAA，編碼Arg的CGG、CGC、CGA，在不改變氨基酸序列的前提下，可將其修飾為更加優(yōu)勢(shì)的密碼子AGA（Arg）。煙草的稀有密碼子為編碼TER的UAG、UGA、UAA，編碼Arg的CGG、CGC，編碼Thr的ACG，其中可替換為更優(yōu)勢(shì)的密碼子AGA（Arg）。擬南芥的稀有密碼子為編碼TER的UAG、UGA、UAA，編碼Arg的CGC、CGG，編碼Pro的CCC，其中可修飾為更優(yōu)勢(shì)的密碼子AGA（Arg）、CCU（Pro）。

3 小結(jié)與討論

密碼子使用偏好性是在生命體翻譯過(guò)程中廣泛存在的自然現(xiàn)象，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是物種在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中突變、選擇的綜合結(jié)果。已有研究表明，密碼子使用偏好性與基因的表達(dá)水平相關(guān)，高表達(dá)基因傾向使用最優(yōu)密碼子，從而可以保證其翻譯的效率和準(zhǔn)確率。為了在異源體系中，更好地提高目的基因的表達(dá)量，可對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造，將異源體系中稀有密碼子替換為優(yōu)勢(shì)密碼子。

酵母常作為真核表達(dá)系統(tǒng)，而原核表達(dá)系統(tǒng)常常為大腸桿菌。在確定了宿主表達(dá)系統(tǒng)的前提下，要實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，對(duì)目的基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化是行之有效的方法。比如，構(gòu)建產(chǎn)咖啡酸基因工程菌時(shí)，對(duì)所涉及的酪氨酸脫氨酸（TAL），C3H與CYP199A2基因均開(kāi)展了密碼子偏好性分析與優(yōu)化，使其能夠適應(yīng)在大腸桿菌中表達(dá)。

通過(guò)對(duì)川芎轉(zhuǎn)錄組密碼子的偏好性分析，可以發(fā)現(xiàn)川芎轉(zhuǎn)錄組密碼子對(duì)以A或T結(jié)尾的密碼子有明顯的使用偏好性。大腸桿菌是表達(dá)最困難的宿主，這與它們來(lái)源于真核生物有著密切的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于川芎阿魏酸生物合成相關(guān)基因來(lái)說(shuō)，其密碼子偏好性同酵母基因組較為接近。這就表明相較于大腸桿菌，酵母更加適合作為川芎基因的表達(dá)系統(tǒng)。但決明基因密碼子與酵母基因組密碼子的使用頻率仍存在差異（如C54052），若要使川芎基因能夠在酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，需要對(duì)其密碼子進(jìn)行優(yōu)化。

已成功克隆了2條川芎COMT基因（C41658與C55080，登錄號(hào)分別為Q6T1F5和KU942388），其中C41658在大腸桿菌中獲得了成功表達(dá)，并完成了功能鑒定；而C55080在大腸桿菌中未獲得表達(dá)。比較兩者的稀有密碼子數(shù)目（以大腸桿菌為宿主），發(fā)現(xiàn)C41658稀有密碼子數(shù)目較少，只有4個(gè)，而C55080稀有密碼子數(shù)目較多，有7個(gè)，這表明密碼子偏好性分析結(jié)果與具體的試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果高度吻合，可信度較高，能夠用于指導(dǎo)相關(guān)基因的異源表達(dá)。

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