吲哚美辛親水凝膠貼劑定量方法與前處理提取工藝正交優(yōu)化

郭文韜 ，謝偉杰 ，2，張永萍 ，徐 劍

（1貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002； 2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

吲哚美辛親水凝膠貼劑定量方法與前處理提取工藝正交優(yōu)化

郭文韜1，謝偉杰1，2，張永萍1，徐 劍1

（1貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002； 2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

目的優(yōu)化吲哚美辛親水凝膠貼劑的提取工藝與含量測(cè)定方法。方法利用高效液相色譜(HPLC)－工作曲線進(jìn)行定量，通過(guò)單因素考察與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化貼劑的提取方法、提取溶劑、時(shí)間與預(yù)處理方法。結(jié)果最終確定貼劑的提取條件是將貼劑膏體剪碎后，50 mL甲醇提取90 min，提取1次，或用25 mL甲醇提取60 min，提取2次。結(jié)論優(yōu)化的貼劑中藥物提取工藝條件穩(wěn)定、可靠，可為貼劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供良好的方法。

正交設(shè)計(jì)；提取工藝；吲哚美辛；含量測(cè)定；親水凝膠；貼劑

吲哚美辛為非甾體類鎮(zhèn)痛抗炎藥，具有載藥量大、適用范圍廣、貼敷性與保濕性好、無(wú)致敏性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多種炎性疼痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果，但該藥口服制劑常規(guī)劑量即可引發(fā)部分患者胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用，故現(xiàn)在多采用經(jīng)皮給藥[1－2]。前期對(duì)吲哚美辛藥物透皮特性與pH的關(guān)系、吲哚美辛新型親水凝膠基質(zhì)處方等[3－5]進(jìn)行了考察，成功制備了吲哚美辛親水凝膠貼劑。本研究中通過(guò)單因素考察與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)該貼劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了初步研究，建立了該貼劑含藥量檢測(cè)方法，確定了含藥量，為付罐促滲新技術(shù)[6]研究奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AE／240型電子天平（上海梅特勒儀器有限公司）；JA2003型分析天平（上海良平儀表有限公司）；SK8210HP型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；DZ－2BC型真空干燥箱（天津市泰斯特有限公司）。

1.2 試藥

吲哚美辛對(duì)照品[高效液相色譜(HPLC)法測(cè)得含量約 99.9%，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100258－00904]；吲哚美辛親水凝膠貼劑（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥物制劑實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)為2015051601）；甲醇（色譜純，批號(hào)為 20141010）；乙腈（色譜純，批號(hào)為 20150610）；乙醇（分析純，批號(hào)為20141010），均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20150505）；娃哈哈純凈水；其他試驗(yàn)用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為自制雙蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 主藥含量測(cè)定(HPLC法)

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil ODS－SP 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 － 水 － 冰醋酸（55 ∶44.7 ∶0.3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；柱溫：35 ℃ ；流速：1 mL ／min；進(jìn)樣體積：10 μL。在此條件下，吲哚美辛色譜峰相對(duì)保留時(shí)間（tR）為（11.8 ± 0.2）min，理論板數(shù)不小于 4 000，目標(biāo)峰與相鄰雜質(zhì)峰完全分離，分離度（R）≥2.5。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取吲哚美辛對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容，制成質(zhì)量濃度為 266.40 μg／mL 溶液，作為對(duì)照品貯備液；取2 mL稀釋，定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為53.28 μg／mL的對(duì)照品溶液。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋到不同質(zhì)量濃度。

供試品溶液：取貼劑的提取溶液2 mL，用0.45 μm針筒式微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取不含吲哚美辛的空白親水凝膠貼劑，按提取工藝條件提取后，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在 tR＝（11.9±0.2）min處均出現(xiàn)目標(biāo)成分色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液無(wú)此色譜峰，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品貯備液，稀釋成質(zhì)量濃度依次為 5.328，13.320，26.640，39.960，53.280，79.920，106.560 μg／mL的系列對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度（C）為縱坐標(biāo)、峰面積（A）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 C＝0.030 1 A－0.734 4，r＝0.999 8(n＝7)。結(jié)果表明，吲哚美辛質(zhì)量濃度在 5.328 ～106.560 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD依次為1.00%和 0.66% （n＝ 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，按擬訂色譜條件分別于 2，6，10，14，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為 2.98%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密取同一批號(hào)樣品，依法制備得6份等濃度供試品溶液，在上色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD 為 1.00% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的貼劑樣品6份（膏體為0.275 g），分別加入對(duì)照品，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝提取后依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表 1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 吲哚美辛加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 貼劑提取工藝考察

溶劑種類：按擴(kuò)散池外接口面積3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛貼劑，共3份，每份稱取0.613 g，精密稱定，分別用25 mL的移液管精密吸取甲醇、乙醇、20%的乙醇磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7.3）各 25 mL，置50 mL錐形瓶，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min后，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件，進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積，并計(jì)算吲哚美辛含量。結(jié)果見表2?？梢?，以甲醇為提取溶劑效果最佳，故選用之。

表2 不同種類提取溶劑考察結(jié)果

酸處理：按擴(kuò)散池外接口面積3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛貼劑，共3份，每份稱取0.524 g，精密稱定，使用移液器分別轉(zhuǎn)移2%鹽酸、2%磷酸、蒸餾水各1 mL，置50 mL錐形瓶中，浸潤(rùn)吲哚美辛貼劑膏體5 min，然后用25 mL的移液管精密吸取25 mL的甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min后，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用 0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算吲哚美辛含量。結(jié)果見表3。可見，采用蒸餾水作酸處理效果最佳，故選用之。

表3 不同酸處理考察結(jié)果

貼劑膏體處理：按擴(kuò)散池外接口面積3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛貼劑，共3份，每份稱取0.599 g，精密稱定，分別按如下方法處理。剪碎處理，取1份，用剪刀剪成1 mm×1 mm的小塊；勻漿處理，使用勻漿機(jī)，加入5 mL甲醇中處理2 min，轉(zhuǎn)移到50 mL的錐形瓶中，并精密吸取5 mL甲醇潤(rùn)洗器壁3次；不作處理。加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min后，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，并計(jì)算吲哚美辛含量。結(jié)果見表4?？梢姡捎眉羲樘幚碣N劑膏體，效果最佳，故選用之。

表4 貼劑膏體不同處理方法考察結(jié)果

單因素考察結(jié)果表明，貼劑含量測(cè)定提取時(shí)最優(yōu)方案為將貼劑膏體剪碎后使用甲醇提取，其他不作處理。但剪碎與勻漿處理的提取效果差異不顯著，后期試驗(yàn)中宜靈活選擇。

2.3 貼劑提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)選

2.3.1 因素與水平選擇

[7－9]，在單因素考察基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)貼劑提取工藝的主要影響因素，包括提取方法（因素 A）、溶劑用量（因素 B）、提取時(shí)間（因素 C）進(jìn)行考察。常用的提取方法有回流提取、超聲提取、浸提，由于各提取方法的提取時(shí)間不能采用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，故采用相對(duì)時(shí)間“短、中、長(zhǎng)”分別表示各方法的提取時(shí)間。詳見表5和表6。

表5 提取時(shí)間水平編碼表

表6 影響因素與水平表

2.3.2 正交設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素考察結(jié)果與因素水平表安排 L9（34）正交試驗(yàn)，按“隨機(jī)”的原則取貼劑：每貼按擴(kuò)散池外接口面積3.14 cm2，裁剪為3份，每份分成9小塊，將每塊隨機(jī)分配正交9組，每組于每貼取3塊，依次取3貼，共9塊，精密稱取總質(zhì)量0.550 g。將各組貼劑膏體剪碎處理后，分別按正交表提取，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算各組吲哚美辛的含量。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與直觀分析結(jié)果見表7。

表7 貼劑提取工藝 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與直觀分析結(jié)果

2.3.3 方差分析

用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8?？梢?，因素A、因素B、因素C對(duì)提取工藝具有非常顯著的影響。同時(shí)直觀分析結(jié)果表明，3種因素提取效果A1＞ A3＞ A2，B2＞ B1＞ B3，C3＞ C2＞ C1。因此，確定提取工藝最佳因素水平組合為A1B2C3，即采用回流法，用25 mL甲醇提取120 min，提取1次。

表8 方差分析結(jié)果

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份貼劑（0.550g），按優(yōu)選的工藝條件提取，過(guò)濾后，取2 mL，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定吲哚美辛含量（M，mg），結(jié)合方法學(xué)考察，以重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得樣品中吲哚美辛含量為參比，計(jì)算相對(duì)提取率（Q，%），即為驗(yàn)證組（提取 1次）。

結(jié)合以上研究結(jié)果，取3份樣品分別用甲醇25 mL回流提取2次，每次60 min，第1次提取后精密吸出提取液20 mL，加入25 mL甲醇再次提取，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，過(guò)濾，作為對(duì)比 1 號(hào)組；另取 3 份樣品（0.550 g），分別用甲醇50 mL回流提取90 min，提取1次，作為對(duì)比2號(hào)組，分別測(cè)定M值，計(jì)算Q值。試驗(yàn)結(jié)果見表9。其中對(duì)比1號(hào)組、對(duì)比2號(hào)組較驗(yàn)證組提取效果更好，且對(duì)比2號(hào)組優(yōu)于對(duì)比1號(hào)組，但組間差異均不大。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)與對(duì)比組結(jié)果

2.4 提取工藝確定

通過(guò)單因素考察與正交試驗(yàn)優(yōu)選，結(jié)合后期研究結(jié)果，確定采用對(duì)比2組方法提取貼劑中吲哚美辛含量：將貼劑膏體（固定面積 3.14 cm2，質(zhì)量 0.5 ～ 0.6g）剪碎后，用50 mL甲醇提取90 min，提取1次。若提取透皮后皮膚中吲哚美辛含量，可采用對(duì)比1組方法提?。簩①N劑膏體（固定面積 3.14 cm2，質(zhì)量 0.5 ～ 0.6 g）剪碎后，用25 mL甲醇提取60 min，提取2次。

2.5 載藥量測(cè)定

根據(jù)提取方法優(yōu)選結(jié)果，取各組制備貼劑，各取3貼，取貼劑部分膏體 0.6 ～0.7 g，剪碎后，用 50 mL 甲醇提取90 min，提取1次。按定量方法測(cè)定各組樣品貼劑載藥量，同時(shí)計(jì)算與12.5 mg標(biāo)示量的偏差（%）。結(jié)果見表 10?？梢?，各組貼劑含藥量基本處于（12.5 ± 0.5）mg，偏差率0.5%，即該制劑產(chǎn)品質(zhì)量基本穩(wěn)定。

表10 各組貼劑含藥量考察結(jié)果（n＝3）

2.6 貼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步評(píng)價(jià)

對(duì)吲哚美辛貼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[10－13]。

處方組成：聚乙烯醇（PVA）17.350 g、明膠 9.999 g、聚乙烯吡咯烷酮6.260 g、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）8.140 g、卡波姆 3.000 g、甘油 12.880 g、丙二醇 12.880 g、三乙醇胺4.200 g，加5%薄荷油作為促滲劑，載藥量12.5 ～ 13.0 mg。

性狀：該制劑產(chǎn)品為無(wú)色透明、柔軟而富有彈性、凝膠薄片狀貼劑。加入薄荷油后略顯淡黃色。

規(guī)格：直徑7 cm圓形貼片，載藥量12.5 mg。

貼劑成品見圖2。

圖2 吲哚美辛親水凝膠貼劑成品圖

3 討論

本研究中對(duì)吲哚美辛親水凝膠貼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的“含量測(cè)定”進(jìn)行全面考察。結(jié)合2010年版《中國(guó)藥典(二部)》確定的高效液相色譜定量條件[7－15]。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于吲哚美辛親水凝膠貼劑離體透皮含量測(cè)定。

本研究中利用單因素考察與正交設(shè)計(jì)[7－8]考察了貼劑提取的工藝條件，為貼劑含量測(cè)定提供了可靠的工藝條件，提供了貼劑在體皮膚組織給藥后測(cè)定優(yōu)化方案，最終確定了貼劑的提取條件，同時(shí)對(duì)各組貼劑含藥量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，該制劑產(chǎn)品質(zhì)量基本穩(wěn)定，為后期促滲在體研究奠定了良好的方法基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步確定該新型貼劑的質(zhì)量，后期研究主要采用體內(nèi)外透皮釋放與載體吸收藥動(dòng)學(xué)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)研究。

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Optimization of Extraction Process of Quantitative Method and Pretreatment of Indomethacin Hydrophilic Gel Patch by Orthogonal Design

Guo Wentao1， Xie Weijie1，2， Zhang Yongping1， Xu Jian1
(1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou， China 550002； 2.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Beijing Union Medical College， Beijing， China 100193）

Objective To optimize the extraction process and content determination method of Indomethacin Hydrophilic Gel Patch.Methods Quantitative analysis was performed by using HPLC － working curves，the extraction method，extracting solvent，time and pretreatment method were extracted by means of single factor and orthogonal design optimization.Results Finally，the extraction conditions of the patch were：after the patch paste was cut and broken，50 mL methanol was extracted for 90 min and extracted 1 time， or 25 mL methanol was extracted for 60 min and extracted 2 times.Conclusion Drug extraction process conditions in optimized patches is stable and reliable，which provides a good method for the quality evaluation of the patch.

orthogonal design；extraction process；indometacin；content determination；hydrophilic gel；patch

TQ460.6；R944.2

A

1006－4931(2017)20－0013－05

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.004

國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目[2014FU125Q09]；貴州省科技廳“百層次人才”培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目[黔科合人才[2015]4030號(hào)]；貴州省教育廳中藥民族藥（苗藥）新劑型新制劑工程研究中心項(xiàng)目[黔教合KY字[2014]22號(hào)]；貴州省普通高等學(xué)校中藥民族藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[黔教合KY字[2016]005]。

郭文韜，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樾滤庨_發(fā)，（電子信箱）479513290＠qq.com。

張永萍，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滤庨_發(fā)，（電話）0851－5652056（電子信箱）642055255＠qq.com。

2017－05－23；

2017－07－10)