唐 靜，金利華，李英英，高 潔，王 燕，楊銀霞

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 710246；2.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710119；3.西北有色金屬研究院，陜西 西安 710016)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化南五味子多糖的提取工藝

唐 靜1，2，金利華3，李英英2，高 潔1，王 燕1，楊銀霞1

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 710246；2.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，
陜西 西安 710119；3.西北有色金屬研究院，陜西 西安 710016)

以蒸餾水為溶劑提取南五味子多糖，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了提取時間、液固比和提取溫度對南五味子多糖提取率的影響；然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，以提取時間、液固比和提取溫度為變量，采用響應(yīng)曲面法研究了各變量及其交互作用對多糖提取率的影響，并建立二次多項(xiàng)式回歸方程預(yù)測模型。結(jié)果表明，在提取時間為3 h、液固比為20∶1(mL∶g)、提取溫度為75 ℃時，多糖提取率達(dá)到最高，為3.14%，且與模型預(yù)測值接近。

南五味子；多糖；響應(yīng)曲面法；優(yōu)化；提取工藝

五味子是木蘭科北五味子或南五味子的干燥成熟果實(shí)，也叫烏梅子、玄及、會及、山花椒等，是一種多功能、多用途的藥食兼用型經(jīng)濟(jì)植物[1]。南五味子多糖是一種理想的免疫增強(qiáng)劑，有激活免疫細(xì)胞、提高免疫功能等作用[2-4]。近年來，由于植物多糖在醫(yī)藥等方面的重要作用，研究者對從天然植物中提取多糖表現(xiàn)出極大的興趣，尤其是對多糖提取工藝的優(yōu)化研究較多。在提取工藝優(yōu)化方面應(yīng)用較廣泛的是響應(yīng)曲面法(response surface methodology,RSM)，RSM可以探究各考察因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系及其交互作用，確定各因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)曲面法采用Box-Behnken設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，在中心點(diǎn)反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)精度，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)[5-6]，中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)曲面分析擬合得到二次多項(xiàng)式模型，將數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)合起來，精確得到各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[7-9]。

作者在此通過單因素實(shí)驗(yàn)確定提取南五味子多糖的合理實(shí)驗(yàn)條件范圍，并在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對南五味子多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為南五味子的綜合利用提供幫助，為南五味子的藥理活性和藥用價值研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

南五味子，產(chǎn)自陜西省漢中市，清洗，烘干，備用。

無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；IKA RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA集團(tuán)；PD-113-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CP224S型電子天平，德國Sartorius集團(tuán)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵，西安太康生物科技有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HC-1000Y型高速多功能粉碎機(jī)，永康天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.2 南五味子多糖的提取

將干燥的南五味子果實(shí)粉碎過40目篩，取5 g南五味子粉末于圓底燒瓶中，加入一定量二次蒸餾水，于恒溫水浴中提取一定時間，抽濾，得提取液。將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后加入一定量無水乙醇進(jìn)行沉淀，靜置24 h，過濾得沉淀物，即南五味子多糖。

1.3 南五味子多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[10]測定南五味子多糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.995 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成6個不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、1.00、1.20，mg·mL-1)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，加入1.0 mL 5.0%的新制苯酚溶液及5.0 mL濃硫酸，混勻，靜置15 min，冷卻10 min，測定492 nm處吸光度，以二次蒸餾水作為空白對照。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合數(shù)據(jù)得線性回歸方程：y=10x+0.04767，相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，線性范圍0.02～0.12 mg·mL-1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

取一定量南五味子多糖，用二次蒸餾水溶解并定容于25 mL容量瓶中，精密移取1.0 mL按上述方法測定492 nm處的吸光度，以二次蒸餾水作空白對照。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到南五味子多糖含量，計算多糖提取率。

1.4 南五味子多糖提取工藝優(yōu)化

先采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察提取時間、液固比、提取溫度對多糖提取率的影響；然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考核指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化南五味子多糖提取工藝。響應(yīng)曲面法的因素與水平見表1。

表1響應(yīng)曲面法的因素與水平

Tab.1Thefactorsandlevelsofresponsesurfacemethodology

因素水平-101A.提取時間/h234B.液固比/(mL∶g)5∶115∶125∶1C.提取溫度/℃607080

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時間對多糖提取率的影響

稱取南五味子粉末5.0 g于250 mL圓底燒瓶中，按液固比15∶1(mL∶g，下同)加入二次蒸餾水，在50 ℃水浴提取不同時間，考察提取時間對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，多糖提取率隨著提取時間的延長先升高后降低，在提取時間為3 h時，多糖提取率達(dá)到最高。

2.1.2 液固比對多糖提取率的影響

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extractionrate of polysaccharide

稱取南五味子粉末5.0 g于250 mL圓底燒瓶中，分別按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1加入二次蒸餾水，50 ℃水浴提取3 h，考察液固比對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 液固比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extractionrate of polysaccharide

從圖3可以看出，多糖提取率隨著液固比的增大先升高后降低，在液固比為15∶1時，多糖提取率達(dá)到最高。

2.1.3 提取溫度對多糖提取率的影響

稱取南五味子粉末5.0 g于250 mL圓底燒瓶中，按液固比15∶1加入二次蒸餾水，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃提取3 h，考察提取溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，多糖提取率隨提取溫度的升高大體呈升高趨勢，在提取溫度為70 ℃時，多糖提取率達(dá)到最高。

2.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以多糖提取率為指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計17組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸擬合，得到多糖提取率(Y)與所考察的3個因素之間的二次響應(yīng)面回歸方程：Y=-12.93338+1.96575A-0.005025B+0.34293C-0.004AB+0.02325AC+0.002125BC-0.54700A2-0.00362B2-0.003095C2。

二次模型的方差分析結(jié)果見表3。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extractionrate of polysaccharide

表2Box-Behnken設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Results of Box-Behnken design experiment

注：括號內(nèi)為提取率預(yù)測值。

表3二次模型的方差分析

Tab.3Varianceanalysisfortheregressionquadraticmodel

來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型3.8990.4311.900.0018**A0.5110.5113.900.0074**B0.4310.4311.780.0110*C6.400E00310.102.790.1389AB0.0110.010.180.6872AC0.2210.225.950.0448*BC0.1810.184.970.0610A21.2611.2634.690.0006**B20.5510.5515.190.0059**C20.4010.4011.100.0126*殘差0.2570.04失擬項(xiàng)0.1330.041.310.3865純誤差0.1340.03總和4.1516R2=0.9387 R2adj=0.8598

注：＊＊表示P<0.01，極顯著差異；＊表示0.01

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)二次模型繪制各因素對南五味子多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖5所示。

從圖5a可以看出，當(dāng)提取溫度相同時，延長提取時間多糖提取率先升高后降低；當(dāng)提取時間相同時，升高提取溫度多糖提取率也是先升高后降低，而且提取時間對多糖提取率的影響更大。這可能是因?yàn)?，提取溫度升高時，體系內(nèi)分子熱運(yùn)動加快，南五味子多糖能更好地溶于水中；但提取溫度過高，多糖結(jié)構(gòu)會有一部分被破壞，導(dǎo)致多糖提取率略微下降；提取時間延長時，體系內(nèi)熱量慢慢聚集，分子熱運(yùn)動加快，體系中南五味子多糖能更好溶出；但提取時間過長，體系內(nèi)會有部分熱量損失，多糖提取率有所降低。當(dāng)提取時間與提取溫度都較高時多糖提取率達(dá)到最高。

圖5 各因素相互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of the interaction among three factors

從圖5b可以看出，在70 ℃、液固比相同時，多糖提取率隨提取時間的延長出現(xiàn)先升高后降低的趨勢；在70 ℃、提取時間相同時，多糖提取率隨液固比的增大也出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且變化趨勢較提取時間平緩。這是因?yàn)?，液固比較大時，體系內(nèi)分子熱運(yùn)動的空間較大，多糖提取率升高；但液固比過高，體系的熱量聚集程度下降，多糖提取率相應(yīng)降低。當(dāng)提取時間與液固比都較高時多糖提取率達(dá)到最高。

從圖5c可以看出，提取溫度對多糖提取率的影響與液固比有關(guān)，液固比較低時體系熱能沒有充分發(fā)揮作用，分子熱運(yùn)動沒有達(dá)到最大，多糖提取率較低。當(dāng)提取溫度和液固比都較高時多糖提取率達(dá)到最高。

由Design-Expert 8.0軟件得到南五味子多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間3.31 h、液固比19.34∶1、提取溫度74.47 ℃，理論提取率達(dá)到3.0381%。修正后的優(yōu)化條件為：提取時間3 h、液固比20∶1、提取溫度75 ℃。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到南五味子多糖提取率為3.14%，與預(yù)測值接近。表明優(yōu)化得到的南五味子多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價值。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法對南五味子多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：提取時間、液固比及提取溫度對多糖提取率的影響大小順序?yàn)椋禾崛r間>提取溫度>液固比。南五味子多糖提取工藝參數(shù)與多糖提取率的數(shù)學(xué)模型回歸極顯著，擬合度較好，可以用來優(yōu)化南五味子多糖的提取工藝，優(yōu)化后的提取條件為：提取時間3 h、液固比20∶1(mL∶g)、提取溫度75 ℃，在此條件下，多糖提取率為3.14%。

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OptimizationinExtractionProcessofPolysaccharidesfromSchisandrasphenantheraRehd.etWilsbyResponseSurfaceMethodology

TANG Jing1,2,JIN Li-hua3,LI Ying-ying2,GAO Jie1,WANG Yan1,YANG Yin-xia1

(1.SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xi′an710246,China;
2.SchoolofChemistry&ChemicalEngineering,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710119,China;
3.NorthwestInstituteforNonferrousMetalResearch,Xi′an710016,China)

Polysaccharides fromSchisandrasphenantheraRehd.et Wils were extracted using distilled water as solvent,firstly,we investigated the effects of extraction time,liquid-solid ratio,and extraction temperature on the extraction rate by single-factor experiment.Then,based on the single-factor experiment,using extraction rate as an index,extraction time,liquid-solid ratio,and extraction temperature as variables,we studied the effects of each variable and their interactions on extraction rate by response surface methodology(RSM),and established the prediction model of quadratic polynomial regression equation.Results showed that,when extraction time was 3 h,liquid-solid ratio was 20∶1(mL∶g),and extraction temperature was 75 ℃,the extraction rate was the highest of 3.14%,which was close to the predicted value.

SchisandrasphenantheraRehd.et Wils;polysaccharide;response surface methodology;optimization;extraction process

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)10-0049-05

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計劃項(xiàng)目(16JK2036)，2017陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(2945)，陜西國際商貿(mào)學(xué)院校級課題(SMXY201605)，陜西國際商貿(mào)學(xué)院人才引進(jìn)科研啟動經(jīng)費(fèi)

2017-06-02

唐靜(1982-)，女，陜西西安人，講師，博士研究生，研究方向：溶液化學(xué)，E-mail：tangjing224@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.011

唐靜，金利華，李英英，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化南五味子多糖的提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(10)：49-53.