祁思敏，宋勇春，崔侖標(biāo)，焦永軍，祁賢

1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009； 3. 浙江省中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053

·論著·

1株H6N6亞型禽流感病毒分子遺傳特性分析

祁思敏3，宋勇春1，崔侖標(biāo)2，焦永軍2，祁賢2

1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009； 3. 浙江省中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053

本研究采用無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚，從某活禽市場(chǎng)環(huán)境中分離出1株H6N6亞型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/zj18/2013，en/zj18)。通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)BLASTn 進(jìn)行同源性檢索，并采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹?；蜻M(jìn)化樹分析表明，分離株en/zj18的所有8個(gè)基因節(jié)段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)均與近年來(lái)中國(guó)華東地區(qū)流行的H6N6亞型禽流感病毒的相應(yīng)基因位于同一進(jìn)化分支，與參考株的核苷酸同源性達(dá)96.7%～99.6%。分離株en/zj18的HA蛋白裂解位點(diǎn)為PQIETR↓GL，是低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白上關(guān)鍵受體結(jié)合位點(diǎn)190和228位(按H3亞型的HA蛋白序列排序)氨基酸分別是E和G，理論上更易與α2，3-半乳糖苷唾液酸受體結(jié)合。結(jié)果提示，需加強(qiáng)活禽市場(chǎng)禽流感病毒的持續(xù)監(jiān)測(cè)，從而為有效應(yīng)對(duì)禽流感病毒對(duì)公共衛(wèi)生的持續(xù)威脅提供科學(xué)依據(jù)。

禽流感病毒；H6N6亞型；病毒分離；基因組測(cè)序

甲型流感病毒(influenza A virus)屬正黏病毒科，基因組由8個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成。RNA可編碼的蛋白包括RNA聚合酶(PB1、PB2和PA)、血凝素(hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)、核蛋白(nuclear protein，NP)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2/NEP、PB1-F2等)。HA和NA是病毒粒子的兩個(gè)重要表面糖蛋白，根據(jù)其抗原性差異，甲型流感病毒可分為不同亞型。作為甲型流感病毒的主要自然儲(chǔ)存宿主，野生水禽中已發(fā)現(xiàn)16種HA亞型和9種NA亞型。近年來(lái)，在中美洲蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的HA亞型(H17和H18)和NA亞型(N10和N11)[1]。

突破種屬障礙實(shí)現(xiàn)跨種感染或傳播，是甲型流感病毒進(jìn)化的一個(gè)顯著特點(diǎn)。由于宿主限制性因素的制約，禽流感病毒跨種感染人的概率很低。但自1996年H5N1亞型禽流感病毒在東亞出現(xiàn)以來(lái)，人感染禽流感病毒的病例頻繁發(fā)生，禽流感成為持續(xù)引人注目的重大公共衛(wèi)生事件。目前報(bào)道能感染人的禽流感病毒主要有H5、H9、H7和H10等亞型[2-5]。

2013年，中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次報(bào)道1例人感染H6N1亞型禽流感病毒[6-7]，表明H6亞型禽流感病毒能跨種感染人，對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生的潛在威脅不容忽視。2013年，本研究從江蘇省鎮(zhèn)江市某活禽市場(chǎng)的環(huán)境樣本中分離到1株H6N6亞型禽流感病毒，在全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上對(duì)其基因起源和遺傳特征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；ExTaq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、RNA酶抑制劑(ribonuclease inhibitor，RANsin)和隨機(jī)引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； Nextera XT DNA Sample Preparation Kit及Illumina MiSeq測(cè)序系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Illumina公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；High Sensitivity DNA Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.1.2引物根據(jù)甲型流感病毒基因片段的核苷酸保守序列設(shè)計(jì)病毒通用引物UFLUA-IF和UFLUA-IR用于擴(kuò)增病毒的全基因組，反轉(zhuǎn)錄引物為Uni12(M)[8]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1病毒分離2013年在江蘇省鎮(zhèn)江市某菜市場(chǎng)活禽銷售攤位，用病毒采樣拭子擦拭籠具表面，置于采樣液中。將標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)無(wú)菌處理，取200 μL接種9～11日齡無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚，37 ℃培養(yǎng)72 h，每天觀察雞胚生長(zhǎng)情況。上述所有操作均在生物安全三級(jí)(biosafety level 3，BSL-3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2.2血凝試驗(yàn)用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)配制1%雞紅細(xì)胞，按常規(guī)方法于96孔微量血凝板上進(jìn)行血凝試驗(yàn)。

1.2.3實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)采用病毒RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取病毒RNA，-70 ℃保存。采用One-step RT-PCR 試劑盒(Qiagen公司)，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)分離株，靶基因?yàn)榧仔土鞲胁《镜腗基因。引物探針序列為：FluA-Forward：5′-GACCRATCCTGTC-ACCTCTGAC-3′；FluA-Reverse： 5′-GGGCATT-YTGGACAAAKCGTCTACG-3′；FluA-probe：5′-FAMTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACGBHQ-3′。反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 30 min；95 ℃ 2 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.2.4測(cè)序提取病毒基因組RNA，以U12反轉(zhuǎn)錄引物生成單鏈cDNA，采用甲型流感病毒通用引物一步法擴(kuò)增流感病毒基因組8個(gè)節(jié)段。將純化的PCR產(chǎn)物定量后，稀釋至0.2 ng/μL，按Nextera XT DNA Sample Preparation Kit說(shuō)明書構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，步驟包括DNA Tagmentation、PCR擴(kuò)增、純化、文庫(kù)標(biāo)化及混合。取800 μL混合液加入MiSeq 測(cè)序試劑樣品孔，進(jìn)行全基因序列測(cè)定，采用CLC Genomics Workbench (CLC Bio)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接整理。

1.2.5進(jìn)化樹構(gòu)建將拼接完整的全基因組序列用基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進(jìn)行同源性檢索，MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，用Bootstrap重復(fù)抽樣1 000次對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

將處理好的標(biāo)本接種SPF雞胚，24～72 h后接種的雞胚全部死亡，收集尿囊液，貯存于-70 ℃?zhèn)溆?。尿囊液血凝效價(jià)為29。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)尿囊液甲型流感病毒M基因核酸陽(yáng)性。分離株命名為A/environment/Zhenjiang/zj18/2013(en/zj18)。

2.2 基因來(lái)源分析

通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)，在標(biāo)本SPF雞胚接種物中獲得分離株en/zj18的全基因組序列(8個(gè)基因的GenBank序列號(hào)為KJ938655～KJ938662)。通過(guò)BLASTn軟件在線分析，初步確定分離株en/zj18為H6N6亞型。為探究病毒的基因來(lái)源，將分離株en/zj18的8個(gè)基因片段序列與參考株的核苷酸同源性進(jìn)行比較分析，確認(rèn)8個(gè)片段中核苷酸最大相似性的參考株(表1)。分離株en/zj18 的8個(gè)基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)的核苷酸與近年來(lái)中國(guó)南方地區(qū)流行的H6N6禽流感病毒〔如A/chicken/Zhejiang/727023/2014 (H6N6)等〕的同源性高達(dá)96.7%～99.6%。

表1分離株en/zj18與參考株基因組核苷酸同源性

Tab.1Nucleotidesequenceidentitybetweenen/zj18andreferencestrainsavailableinGenBank

GenesegmentClosestinfluenzavirusrelativeNucleotideidentity(%)PB2A/chicken/Hunan/S3003/2009(H6N6)99.6PB1A/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)96.7PAA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)98.8HAA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)96.9NPA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)97.9NAA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)97.7MA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6))99.0NSA/chicken/Zhejiang/727023/2014(H6N6)98.5

為進(jìn)一步明確分離株en/zj18的基因進(jìn)化來(lái)源，用鄰位法構(gòu)建分離株en/zj18的8基因進(jìn)化樹。在HA和NA基因進(jìn)化樹上，分離株en/zj18與中國(guó)浙江流行的H6N6毒株處于一個(gè)分支(圖1、圖2)；其他6個(gè)片段(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)則與近年來(lái)流行的H6N6毒株處于一個(gè)進(jìn)化分支(資料未顯示)，進(jìn)一步證實(shí)分離株en/zj18屬于近年來(lái)流行于中國(guó)南方地區(qū)的H6N6亞型病毒。

2.3 編碼蛋白的分子特征

通過(guò)分析毒株en/zj18全基因組序列，對(duì)其編碼蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，這些位點(diǎn)主要涉及病毒的毒力、跨種傳播能力和耐藥性等。結(jié)果顯示，毒株en/zj18的HA基因編碼566個(gè)氨基酸組成的蛋白，N端為由15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。在體內(nèi)蛋白酶作用下，HA蛋白裂解為HA1(328個(gè)氨基酸)和HA2(222個(gè)氨基酸)兩部分，裂解位點(diǎn)由1個(gè)堿性氨基酸R連接(裂解位點(diǎn)氨基酸序列為PQIETR↓GL)，符合低致病性禽流感病毒的分子特性。理論上，HA蛋白有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)位于HA1，2個(gè)位于HA2。對(duì)受體結(jié)合特性有重要影響的氨基酸位點(diǎn)是S137、P186、E190、Q226和G228(以H3亞型HA蛋白序列排序)，理論上更易與α2，3-半乳糖苷唾液酸(sialic acid α2，3-galactose，SAα2-3Gal)受體結(jié)合。

NA蛋白由470個(gè)氨基酸組成，有8個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，沒(méi)有出現(xiàn)氨基酸缺失。H276 和R294 位點(diǎn)未發(fā)生突變，表明病毒對(duì)NA抑制劑敏感。PB2蛋白的Q591、E627和D701位點(diǎn)未發(fā)生適應(yīng)感染哺乳動(dòng)物的突變。由于2個(gè)密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，PB1-F2蛋白分別在35和88位出現(xiàn)斷裂。NS1蛋白開放讀碼框(open reading frame，ORF)652～654位核苷酸突變?yōu)榻K止密碼子，NS1蛋白包含217個(gè)氨基酸，失去C端ESEV基序。

圖1分離株en/zj18的HA基因進(jìn)化樹分析

Fig.1ThephylogenetictreeofHAgeneofen/zj18

3 討論

HA蛋白是甲型流感病毒的重要表面糖蛋白，通過(guò)位于HA1的受體結(jié)合位點(diǎn)(receptor binding site，RBS)與宿主細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸受體結(jié)合，完成受體介導(dǎo)的胞吞過(guò)程，病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[9]。HA蛋白的唾液酸受體有兩類：禽類消化道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的SAα2，3Gal和人上呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的SAα2，6Gal。HA受體結(jié)合特性由SAα2，3Gal親嗜性向SAα2，6Gal親嗜性的轉(zhuǎn)變，被認(rèn)為是禽流感病毒跨種感染人的一個(gè)重要前提[2,9]。病毒RBS位于HA1頭部，由3個(gè)較為保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)域組成：130-loop、220-loop和190-helix，其中一些氨基酸殘基在受體親嗜性方面起關(guān)鍵作用，包括220-loop上的225、226和228位殘基，以及190-helix上的190位殘基[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在不同亞型的甲型流感病毒中，這些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變對(duì)受體結(jié)合特性的影響有差異。對(duì)H1亞型病毒來(lái)說(shuō)，E190D和G225D位點(diǎn)的突變保證了病毒由SAα2，3Gal向SAα2，6Gal親嗜性的轉(zhuǎn)變[10]； 而位點(diǎn)Q226L和G228S的突變對(duì)H2和H3亞型病毒是關(guān)鍵[11-12]。針對(duì)H6亞型病毒，Wang等研究認(rèn)為，E190V和G228S突變是H6亞型病毒獲得SAα2，6Gal受體結(jié)合能力的關(guān)鍵，而P186L突變能減弱病毒對(duì)SAα2，3Gal 受體的結(jié)合力[13]。Ni等認(rèn)為，S137N/E190V/G228S三位點(diǎn)組合突變是病毒結(jié)合人受體的分子基礎(chǔ)[14]。上述4個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)谥袊?guó)臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道的感染人病毒株A/Taiwan/2/2013(H6N1)中均有體現(xiàn)[13]。但Tzarum等和Yang等研究[15-16]認(rèn)為，與禽分離株一樣，H6N1人分離株仍保留對(duì)禽類受體較強(qiáng)的結(jié)合能力；與其他亞型不同，H6亞型HA蛋白可能有其他未知位點(diǎn)對(duì)受體轉(zhuǎn)變有貢獻(xiàn)。由此可見，對(duì)于H6亞型來(lái)說(shuō)，受體結(jié)合特性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究中，分離株HA位點(diǎn)S137、P186、E190、Q226和G228均未突變，理論上對(duì)SAα2，6Gal受體的結(jié)合能力較弱，是典型的禽受體結(jié)合特征。此外，分離株en/zj18的PB2蛋白Q591、E627和D701位點(diǎn)未發(fā)生突變，提示該病毒在人體內(nèi)復(fù)制能力較差。雖然分離株en/zj18不具備感染人的某些分子特征，但其進(jìn)化變異趨勢(shì)值得關(guān)注，持續(xù)的點(diǎn)突變也可能增強(qiáng)H6N6對(duì)人體的感染力，從而產(chǎn)生引起人類流感大流行的新毒株。

圖2分離株en/zj18的NA基因進(jìn)化樹分析

Fig.2ThephylogenetictreeofNAgeneofen/zj18

1965年，H6亞型病毒首次從美國(guó)火雞中分離獲得，目前在全球野生水禽中廣泛分布[17-18]。中國(guó)南方地區(qū)家禽養(yǎng)殖密度大，雞、鴨、鵝等混養(yǎng)現(xiàn)象普遍。除H5、H9和H7亞型外，H6也是禽類中的常見流行亞型。國(guó)內(nèi)研究表明，2000年以來(lái)我國(guó)H6亞型在宿主分布和亞型進(jìn)化中呈動(dòng)態(tài)變化[19-20]。H6亞型最初主要在家鴨中流行，然后逐漸跨種感染鵝、雞、鵪鶉等家禽；進(jìn)化過(guò)程中，H6N6逐漸替代H6N2成為優(yōu)勢(shì)亞型，目前出現(xiàn)H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8亞型共同流行的局面。中國(guó)南方地區(qū)氣候濕潤(rùn)，水網(wǎng)密布，是東亞候鳥遷徙的重要中轉(zhuǎn)站，為流感病毒在野禽與家禽間的基因交換提供了便利。此外，混合養(yǎng)殖和活禽市場(chǎng)消費(fèi)模式也極大促進(jìn)了病毒通過(guò)基因重配的快速進(jìn)化。

分離株en/zj18的HA蛋白裂解位點(diǎn)僅含1個(gè)堿性氨基酸，不符合高致病性禽流感病毒的分子特征。美國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的研究顯示，H6亞型病毒對(duì)家禽有一定的致病性，包括產(chǎn)蛋下降和引起上呼吸道癥狀等[21-22]。國(guó)內(nèi)分離的H6亞型病毒大多從無(wú)臨床癥狀的禽類中獲得[19-20]。H5和H9亞型禽流感疫苗在大陸的廣泛應(yīng)用，能否使家禽對(duì)H6亞型病毒產(chǎn)生部分交叉免疫保護(hù)，目前尚不清楚。因此，國(guó)內(nèi)基因型復(fù)雜的H6亞型禽流感病毒對(duì)家禽的致病性還需進(jìn)一步研究。除感染人的報(bào)道外，H6亞型病毒也可感染小鼠、雪貂和豚鼠，并引發(fā)疾病[23-25]。此外，H6亞型病毒還可自然感染豬[26-27]，對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)力在增強(qiáng)[25]，其公共衛(wèi)生意義不容忽視。

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s. SONG Yongchun, E-mail: songyc@nju.edu.cn; QI Xian, E-mail: qixiansyc@163.com

MolecularcharacterizationofoneH6N6subtypeavianinfluenzavirusisolatedfromalivepoultrymarketinZhenjiang

QI Simin3, SONG Yongchun1, CUI Lunbiao2, JIAO Yongjun2, QI Xian2

1.SchoolofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093,China; 2.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China; 3.CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China

One H6N6 subtype avian influenza virus 〔A/environment/Zhenjiang/zj18/2013 (en/zj18)〕 was isolated from a live poultry market in Zhenjiang in an epidemiological surveillance and was subjected to genome sequencing and further analysis. Next-generation sequencing (NGS) by Illumina MiSeq Platform was used to obtain the complete genome sequence from the isolated virus. MEGA5.0 software was used to align the eight fragments respectively. The phylogenetic and molecular characteristics of the isolate were analyzed by Neighbor-Joining method. BLAST searches demonstrated that the 8 genes (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M and NS) had 96.7%-99.6% nucleotide identity with the ones on the H6N6 subtype reference viruses circulating in southeast China. The enzyme cleavage site on HA was PQIETR↓GL, which was the typical characteristic of the low pathogenic avian influenza virus (LPAIV). The key HA receptor binding sites were E190 and G228, indicating a preference binding for α2-3-linked sialic acids. The results suggest that it is necessary to strengthen the continuous surveillance of avian influenza A viruses.

Avian influenza virus; H6N6 subtype; Virus isolation; Genome sequencing

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370079)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK2013145)

宋勇春，祁賢

2017-02-10)