曹玉瑤,王維維，周宣羽,劉紅艷,丁青根，單玲玲

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，生物技術(shù)藥物研究所，宿州，234000

2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇兩性小分子單體的制備與表征

曹玉瑤,王維維，周宣羽,劉紅艷,丁青根，單玲玲*

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，生物技術(shù)藥物研究所，宿州，234000

在前期研究的基礎(chǔ)上，選用已制備的2-氨基葡萄糖和熒光染料(2DA-FITC )作為“導(dǎo)向基團(tuán)”靶向高表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體GLUT1的腫瘤細(xì)胞和組織，并將其作為兩性小分子的親水端，共價(jià)偶聯(lián)紫杉醇-谷氨酸(PTX-Glu)作為兩性小分子疏水端，合成同時(shí)具有親水性和疏水性的2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體，并用LC-MS和核磁共振氫譜1H-NMR對(duì)2DA-FITC-PTX進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明已成功制備2DA-FITC-PTX兩性小分子單體。

兩性小分子；2-氨基葡萄糖； 紫杉醇

目前，臨床上廣泛使用的小分子和高分子藥物都存在以下缺點(diǎn)：(1)小分子藥物通過(guò)口服或注射給藥，短時(shí)間內(nèi)體內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)超過(guò)實(shí)際需求量，且無(wú)選擇性；新陳代謝快、半衰期短、體內(nèi)濃度很快降低而影響療效，故需要大劑量給藥，而過(guò)高的藥物濃度又會(huì)增強(qiáng)藥物的副作用[1]；(2)生物高分子藥物在體內(nèi)易被酶降解或失活，生物半衰期短， 需重復(fù)給藥；還受到如免疫系統(tǒng)、組織、細(xì)胞膜等的限制，多數(shù)不易通過(guò)這些生物屏障，因而高分子藥物的生物利用度較低[2]。因此，如何提高化學(xué)藥物的局部濃度，減少全身毒副反應(yīng)，一直是學(xué)界研究的熱門課題。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)難溶性化學(xué)藥物劑型的研究取得一些進(jìn)展，其中將難溶性化學(xué)藥物構(gòu)建成腫瘤靶向性納米粒子載藥系統(tǒng)是重要方法之一。用于藥物輸送的納米粒子材料主要是高分子聚合物，載有藥物的聚合物納米粒子通常以膠體分散體的形式通過(guò)口服或經(jīng)皮、皮下和肌肉注射，動(dòng)脈注射，靜脈點(diǎn)滴以及體腔黏膜吸附等給藥途徑進(jìn)入人體[3-4]，但高分子聚合物由于分子量較大，在體內(nèi)很難分散成單體形式給藥[5-6]。因此，學(xué)界嘗試制備結(jié)構(gòu)規(guī)整的兩性腫瘤靶向性小分子，在體內(nèi)釋放靶向性小分子作用于腫瘤組織。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，將已制備的2-氨基葡萄糖-熒光染料(2DA-FITC)作為兩性小分子單體的親水端，共價(jià)偶聯(lián)谷氨酸-紫杉醇前藥中間體，并將其作為兩性小分子單體的疏水端，合成兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥，采用LC-MS和1H-NMR對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1 試劑與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

2-氨基葡萄糖由實(shí)驗(yàn)室制備，紫杉醇(PTX)、谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、熒光染料FITC均購(gòu)買于sigma公司，二氯甲烷(DCM)和4-二甲氨基必定(DMAP)為AR級(jí)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

核磁共振1H-NMR和質(zhì)譜LC-MS檢測(cè)儀器由中國(guó)藥科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 谷氨酸-紫杉醇(Glu-PTX)的合成

稱取100 mg(0.117 mmoL)PTX溶于15 mL的DCM，同時(shí)加入59.7 mg (0.1404 mmol，1.2 eqv)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmoL)，將44.85 mg(0.234mmoL,2eqv)EDC溶于10 mL DCM中，在冰浴條件下，將10 mL溶于EDC溶液，并緩慢滴入到PTX反應(yīng)體系中，大約25 min滴加完畢，除去冰浴，室溫下攪拌26 h，用TLC示蹤。待反應(yīng)完后，用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無(wú)水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后得晶狀體產(chǎn)物谷氨酸-紫杉醇，其結(jié)構(gòu)用LC-MS進(jìn)行分子量鑒定。

1.3.2 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Glu(OtBu)-PTX)中間體的制備

將產(chǎn)物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX中溶于8 mL DCM，并加入100 μL，在室溫下攪拌過(guò)夜，直至出現(xiàn)渾濁，然后用TLC示蹤。將產(chǎn)物再次真空旋蒸除去溶劑，再用乙醚萃取(OtBu溶于乙醚中)，放入冰箱過(guò)夜，將乙醚去除，烘干產(chǎn)物，即得脫去了OtBu的Fmoc-Glu(COOH)-PTX白色晶體。將0.01 mmol Fmoc-Glu(COOH)-PTX溶于DMF中，加入EDC和NHS(摩爾比1∶1.2∶2)活化Fmoc-Glu(COOH)-PTX的羧基，室溫?cái)嚢? h后，加入0.01 mmoL 2DA，室溫下攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化，得到純化的2-氨基-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Fmoc-Glu-PTX)，將2DA-Fmoc-Glu-PTX溶于DCM體系中，再加入2 mL哌啶(使哌啶為總體積的20%)，用乙醚萃取，用TLC示蹤，得到2DA-NH2-Glu-PTX前藥，并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)兩性小分子單體的制備

將0.1 mmoL 2DA-NH2-Glu-PTX前藥中加入7 mL DCM溶解后，加入0.1 mmoL熒光染料FITC，室溫下攪拌過(guò)夜，將反應(yīng)液經(jīng)G15純化，去除沒(méi)有共價(jià)偶聯(lián)的2DA-NH2-Glu-PTX和FITC片段，得到純化的2氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥(2DA-NH2-Glu-PTX-FITC)小分子單體，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 靶向性紫杉醇前藥單體及中間體的表征

用核磁共振氫譜1H和LC-MS對(duì)靶向性紫杉醇藥前藥中間體和單體進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷氨酸-紫杉醇中間體(Glu-PTX)結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與NH2-Glu(OtBu)-PTX的理論分子完全一致，NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS (ESI,m/z): 1283.4([M+H]+) ，如圖1。證明已成功合成谷氨酸-紫杉醇中間體。

圖1 LC-MS鑒定谷氨酸-紫杉醇中間體的分子量 NH2-Glu(OtBu)-PTX: MS (ESI, m/z): 1283.4([M+H]+)

2.2 2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)前藥結(jié)構(gòu)鑒定

用LC-MS對(duì)2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)分子量進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與2DA-PTX前藥理論上分子量完全一致，2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68([M+H]+)，如圖2。由此可證明2DA-PTX前藥已成功地合成。

圖2 LC-MS鑒定2-氨基葡萄糖-紫杉醇分子量 2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68 ([M+H]+)

2.3 兩性小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇(2DA-FITC-PTX )單體結(jié)構(gòu)鑒定

用核磁共振氫譜1H鑒定2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體結(jié)構(gòu)，從氫譜圖可以看出親水端與疏水端共價(jià)偶聯(lián)2-OH位置在4.77 ppm到5.44 ppm之間(圖3)，證明小分子單體的合成。

圖3 核磁氫譜鑒定小分子2-氨基葡萄糖-熒光染料紫杉醇前藥單體

3 結(jié) 論

在傳統(tǒng)抗腫瘤藥物劑型中，存在包封率低、易滲漏、穩(wěn)定性差、毒副作用大和靶向性差等問(wèn)題[7]。兩性小分子自組裝靶向性納米粒子載藥系統(tǒng)，在高效率載藥的同時(shí)，在酸性條件下也可生物降解成小分子靶向性前藥釋放紫杉醇原藥。納米粒子藥物除具有低毒、高效、緩釋、長(zhǎng)效，能識(shí)別變異細(xì)胞，藥物穩(wěn)定性好，藥物釋放后的高分子載體無(wú)毒，不會(huì)長(zhǎng)期積累在體內(nèi)，以及副作用小等優(yōu)點(diǎn)外[8], 還具有更強(qiáng)的定向釋放能力, 是各種藥物的較佳替代品。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，用2-氨基葡萄糖-熒光染料(2-DA-FITC)作為兩性小分子單體的“導(dǎo)向基團(tuán)”和親水端，共價(jià)偶聯(lián)谷氨酸-紫杉醇[(2DA-Glu(OtBu)-PTX]中間體作為兩性小分子單體的疏水端，制備兩性小分子單體2-氨基葡萄糖-熒光染料-紫杉醇前藥(2DA-FITC-PTX)，旨在為進(jìn)一步構(gòu)建靶向性納米藥物傳遞體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

TP273

A

1673-2006(2017)09-0115-03

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.027

2017-07-05

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510379027，201410379014)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A249)；宿州學(xué)院科研平臺(tái)開(kāi)放課題(2016ykf08)。

曹玉瑤(1995-)，女，安徽宿州人，研究方向：腫瘤靶向性藥物的合成與應(yīng)用。

*通信作者：?jiǎn)瘟崃?1971-)，女，安徽宿州人，博士，副教授，研究方向：抗腫瘤藥物及其新劑型。