纖維蛋白膠羊膜棒在去勢雄兔干眼癥的應用研究*

馬明洋 ，葉蕾 ，周雙雙 ，鄒雪香 ，楊啟晨 ，吳安花 ，譚鋼 ，邵毅

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006；2.南華大學第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 衡陽 421001；3.廈門大學眼科研究所，福建 廈門 361102）

基礎研究·論著

纖維蛋白膠羊膜棒在去勢雄兔干眼癥的應用研究*

馬明洋1，葉蕾1，周雙雙2，鄒雪香2，楊啟晨3，吳安花2，譚鋼2，邵毅1

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006；2.南華大學第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 衡陽 421001；3.廈門大學眼科研究所，福建 廈門 361102）

目的研究纖維蛋白膠羊膜棒對去勢雄兔干眼癥的預防和治療作用。方法選取雄性新西蘭大白兔60只（60眼，均為右眼），行雙側睪丸切除術后隨機分為A、B、C、D、E及F 6組（各組10眼）。A組手術后不進行任何處理觀察6周；B組手術當日將纖維蛋白膠羊膜棒植入淚道5 s后取出觀察6周；C組手術當日植入纖維蛋白膠羊膜棒6周；D組造模（手術2個月后形成干眼模型）后不進行任何處理觀察6周；E組造模當日將纖維蛋白膠羊膜棒植入淚道5 s后取出觀察6周；F組造模當日植入纖維蛋白膠羊膜棒6周。分別于植入前和植入后2、4及6周行Schirmer I試驗（SIT）、角膜熒光素染色（FL）、角膜共聚焦顯微鏡掃描和淚道黏膜K16的Western blot檢查。結果C組在植入2、4及6周后SIT較植入之前好轉，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組與A、B組間的SIT在各時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在植入2周后，C組FL指標評分較植入之前無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在植入4和6周后C組與A、B組FL指標評分較植入之前輕度好轉，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在植入2、4及6周后，F組SIT較植入前好轉，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），F組FL指標評分較植入之前好轉，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；植入后C、F組上皮基底細胞和炎癥細胞均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫熒光染色及Western blot結果顯示C、F組淚道黏膜K16陰性表達。結論纖維蛋白膠羊膜棒能夠有效地預防和治療去勢雄兔干眼癥，延緩干眼癥的進展。

纖維蛋白膠羊膜棒；去勢雄兔；干眼

干眼癥是一種常見的眼表疾病，由于淚液的質和（或）量的改變，時常會出現眼部干澀、畏光或視力疲勞等不適癥狀，嚴重影響到日常的生活[1]。從流行病學的角度來看，在美國，65～84歲的人群中干眼癥的患病率高達14.6%[2]。而我國目前還沒有關于干眼癥的流行病學調查，但從基礎醫(yī)療設施和衛(wèi)生環(huán)境狀態(tài)來看，發(fā)病率應高于美國。

纖維蛋白膠羊膜棒是纖維蛋白黏合膠和羊膜的結合，將纖維蛋白黏合膠涂在羊膜棒上并晾干制出纖維蛋白膠羊膜棒。纖維蛋白膠是一種新型的生物膠制品，由血纖維蛋白制成，可以對組織進行粘合同時還具有止血的功效，其特點主要是安全、舒適和易吸收，目前已經廣泛地應用于各種外科手術，針對于眼部疾病主要用于眼表手術的止血和創(chuàng)口粘合。羊膜為人胎膜的內層，無神經、血管及淋巴管，抗原性低，韌性強[3-5]，能夠抑制炎癥，抑制結膜鱗狀上皮化生[6-7]，同時減少新生血管的形成，抑制纖維化，甚至逆轉鱗狀化生[8]。本實驗研究將纖維蛋白膠羊膜棒植入淚道，并與假植入組進行對比，探討植入纖維蛋白膠羊膜棒的應用效果，為以后干眼癥的治療提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

纖維蛋白膠羊膜棒（自制），SchirmerⅠ試紙（博士倫公司），聚氯乙烯濾紙、塑料薄膜（上海半島實業(yè)有限公司），K16抗體（美國Sigma公司）。

1.2 動物分組及手術

選取60例成年雄性健康的新西蘭白兔，1.5月齡，體重1.5～2.0 kg（由南昌大學醫(yī)學院動物實驗部提供）。在實驗進行之前分別使用眼底鏡和裂隙燈顯微鏡對實驗動物的眼底及眼前節(jié)進行檢查，結果顯示無異常，同時 Schirmer I試驗（Schirmer I test，SI T）≥10 mm/5 min。將64例（實際使用60例，有4例造模失?。┬挛魈m大白兔按照馬軼群等[9]的方法行雙側睪丸切除術后隨機分為 A、B、C、D、E、F 6組（各組10眼，均為右眼）：A、B、C 3組為預防實驗（30只），A組陰性對照，手術后不進行任何處理觀察6周；B組手術當日將纖維蛋白膠羊膜棒植入淚道5 s后取出觀察6周；C組手術當日淚道植入纖維蛋白膠羊膜棒，觀察6周；D、E、F組為治療實驗（30例造模成功兔），睪丸切除2個月后形成干眼模型，用SIT和角膜熒光素鈉染色（fluorescent，FL）評分標準進行評判，D組造模成功后不進行任何處理觀察6周；E組造模成功后將纖維蛋白膠羊膜棒植入淚道5 s后取出觀察6周；F組造模成功后淚道植入纖維蛋白膠羊膜棒6周。分別于植入前和植入后2、4及6周行SIT試驗、FL角膜共聚焦顯微鏡掃描和淚道黏膜K16的Western blot檢查。本研究實驗符合動物倫理委員會的要求[10]，對實驗動物的利益進行充分的考慮，盡可能減少實驗動物的應激、痛苦和傷害，尊重動物的生命，處置動物時盡量較少實驗動物的痛苦。

1.3 SIT檢查

首先取有刻度的試紙5 mm×35 mm，將檢測淚液分泌的濾紙一端彎折置于被測眼下結膜囊中外1/3處，剩余部分懸垂在皮膚表面，在測量時實驗動物不滴加任何表面麻醉劑。靜置5 min后取出濾紙并記錄試紙淚液浸潤的長度（不包括反折部分），參照文獻的標準[11]，5 min后測量濾紙上的濕長，認為≥10 mm為正常，＜5 mm為干眼。在檢查過程中注意控制變量，要求由同一操作者在相同條件（時間、地點、溫度、濕度及照明光度）下操作。

1.4 FL評分

將1滴10 g/L熒光素鈉滴于兔下眼結膜囊內并輔助其瞬目，同時在裂隙燈下觀察實驗動物角膜上皮的染色情況，評分系統(tǒng)參考文獻[12]。采用12分法：將角膜劃分為4個象限，依據染色情況分為0～3分/象限，每個象限染色分為無、輕、中及重度，無染色為0分，＜5個點計為1分，≥5個點計為2分，≥5個點并有絲狀物染色或潰瘍計為3分。

1.5 共聚焦顯微鏡檢

采用Confoscan 4裂隙掃描共聚焦顯微鏡（Nidek Co.LTD，日本）檢查兔角膜上皮細胞的情況，該檢查為無創(chuàng)檢查，操作步驟參考文獻[13]：在待檢兔眼表面用5%愛爾卡因進行麻醉后，將兔的頭部固定于顯微鏡前，利用開瞼器充分暴露角膜，實驗人員將鏡頭緩慢的向前推進，全層掃描中央角膜處，觀察視野為 400 μm×400 μm，分辨率 1 μm，放大倍數800倍觀察兔角膜上皮基底層細胞的形態(tài)變化，檢測完畢后選擇有意義的圖像存盤，分別對角膜上皮基底細胞及炎癥細胞的密度進行計算對比。

1.6 Western blot檢查

電泳：選擇80 g/L SDS-PAGE膠電泳對煮過的淚道黏膜蛋白質組織樣品（A、D組未進行任何處理，B、E組進行假植入處理，C、F組進行植入纖維蛋白膠羊膜棒處理）進行電泳分離，通入55 mA電流電泳約2h直至標志物溴酚藍到達凝膠底部；浸潤：PVDF膜在甲醇溶液中浸潤；電轉：穩(wěn)流電轉30～60 min；孵育：移去電泳膠，將PVDF膜置于明膠（濃度為2.5g/L）封閉液中，在室溫環(huán)境下緩慢搖晃持續(xù)30 min或在4℃封閉液內封閉過夜，加入一抗溶液（K16，濃度為1∶150）進行孵育準備，室溫環(huán)境下孵育1～2 h或4℃孵育過夜；沖洗：用TBST沖洗3次，加入與濃度為1∶150的K16一抗溶液相對應的帶辣根過氧化物酶的二抗溶液（濃度為1∶150），在室溫環(huán)境下孵育1～2 h或4℃條件下孵育過夜，TBST漂洗3次，增強型化學發(fā)光劑浸潤自顯影觀察有無條帶。

1.7 統(tǒng)計學方法

數據分析采用Graph Pad Prism 4.00統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，3組間不同時間比較采用重復測量設計的方差分析，兩組時間比較用t檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 預防組手術前后及各組FL評分和SIT結果比較

A、B、C 3組手術前和手術2、4及6周后FL評分、SIT比較，采用重復測量設計的方差分析。結果：①不同時間的FL評分和淚液分泌量有差異（F=9.438和 13.565，P=0.0011和 0.006）；②3組間 FL 評分和SIT有差異（F=21.476和19.763，P=0.002和0.008）；③3組的FL評分和SIT變化趨勢也有差異（F=12.436和 10.147，P=0.004和 0.007）。見表 1。

2.2 治療組治療前后及各組FL評分和SIT結果比較

D、E、F 3組治療前與治療2、4和6周后FL評分和SIT比較，采用重復測量設計的方差分析。結果：①不同時間的FL評分和淚液分泌量有差異（F=19.438和 13.565，P=0.0011和 0.006）；②3組間熒光素染色評分和SIT有差異（F=21.476和15.763，P=0.002和0.008）；③3組的FL評分和SIT變化趨勢也有差異（F=12.436和 10.147，P=0.004和0.007）。見表2。

2.3 植入前后及各組角膜共聚焦顯微鏡檢查結果

A組上皮基底細胞個數較多，無炎癥細胞，分布不均勻。B組可見少數較為光亮的炎癥細胞浸潤，散在分布，C有極少數炎癥細胞浸潤，角膜上皮基底細胞密度略有下降。D組中可見大量光亮的炎癥細胞浸潤，分布明顯不均勻，E組可見大量炎癥細胞浸潤，上皮細胞增生、變形，密度增加，F組炎癥細胞浸潤現象不明顯，角膜上皮基底細胞密度輕度下降。通過炎癥細胞計數可以看出，A組1個月后上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（2.50±1.71）和（0.00±0.00），B組1個月后上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（47.00±13.11）和（250.33±44.12），C 組上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（15.00±10.07）和（86.67±16.04）。A、B和C組干預6周后上皮基底細胞（F=23.815，P=0.004）和炎癥細胞密度比較（F=20.356，P=0.006），差異有統(tǒng)計學意義。D組造模1個月后上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（53.33±17.70）和（223.17±27.83）個 /mm2，E 組造模 1 個月后上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（66.50±15.78）和（210.83±24.94）個 /mm2，F 組植入纖維蛋白膠羊膜棒后上皮基底細胞和炎癥細胞密度分別為（29.33±8.58）和（134.83±31.96）個 /mm2，D、E、F 組治療6周后上皮基底細胞（F=13.871，P=0.021）和炎癥細胞密度（F=16.642，P=0.015）比較，差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 實驗動物預防組手術前后各時段FL評分和SIT結果比較 （n=10，±s）

表1 實驗動物預防組手術前后各時段FL評分和SIT結果比較 （n=10，±s）

注：1）與干預前比較，P ＜0.05；2）與 A 組比較，P ＜0.05；3）與 B 組比較，P ＜0.05

時間 A FL評分B C A SIT B C干預前 1.05±0.40 1.00±0.45 1.10±0.33 9.84±1.95 9.69±1.55 9.96±1.64干預后2 周 2.04±0.481） 2.10±0.531） 1.94±0.641）2）3） 7.54±1.711） 7.63±1.651） 8.417±2.041）2）3）4 周 2.96±0.701） 3.12±0.641） 2.91±0.911）2）3） 6.22±2.061） 6.24±1.991） 6.64±1.061）2）3）6 周 3.28±0.811） 3.35±0.731） 3.06±0.751）2）3） 4.47±1.431） 4.58±1.611） 5.11±1.301）2）3）

表2 實驗動物治療組手術前后各時段FL染色和SIT結果比較 （n=10，±s）

表2 實驗動物治療組手術前后各時段FL染色和SIT結果比較 （n=10，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與 D 組比較，P ＜0.05；3）與 E 組比較，P ＜0.05

時間 D FL評分E F D SIT E F治療前 3.57±0.83 3.63±0.70 3.47±0.87 3.98±1.32 3.99±1.42 3.99±1.36治療后2 周 4.68±1.051） 4.38±1.081） 3.28±1.121）2）3） 3.81±1.451） 3.74±1.391） 4.66±1.551）2）3）4 周 5.01±1.221） 5.15±1.281） 2.91±0.781）2）3） 3.53±1.421） 3.02±1.441） 5.53±1.331）2）3）6 周 5.53±1.141） 5.60±1.291） 3.31±0.821）2）3） 3.21±1.191） 3.02±1.441） 4.67±1.531）2）3）

圖1 各組角膜上皮細胞的共聚焦顯微圖像

2.4 兔淚道組織K16檢測情況

分別取 A、B、C、D、E、F 組的淚道組織，各組淚道均未發(fā)生粘合，各組K16均為陰性表達。見圖2。

圖2 各組兔淚道組織K16的Western blot檢測結果

3 討論

我國干眼癥的發(fā)病率呈現上升趨勢，發(fā)病年齡逐漸降低，導致干眼癥的主要原因之一為性激素水平的下降，雄激素對機體的免疫功能具有調節(jié)作用，能夠調控淚腺和瞼板腺的功能，調節(jié)眼的淚液穩(wěn)定、炎癥反應和細胞凋亡。雄激素水平下降可由多種原因導致，包括服用抗雄激素類藥物、停經或自身免疫性疾病等，由于雄激素水平下降，導致淚膜細胞不穩(wěn)定、炎癥反應和腺體細胞凋亡加重，最終結果導致干眼癥。眼是性激素作用的靶器官，有相關研究表明，睪酮水平與淚液分泌量之間呈正相關性[14]。除此之外，雄激素缺乏可加快Sogren綜合征的進展，與重癥干眼癥有關[15]。而采用激素替代療法存在很多難以避免的副作用，因此干眼癥的治療方法仍然是一個亟待解決的問題。目前，國內對于輕度干眼癥主要采取人工淚液點眼治療，僅能達到緩解癥狀的目的，對于中重度干眼癥效果不佳。同時，對于中重度干眼癥，不僅僅是淚液的改變，其眼表上皮細胞和淚液中均出現炎癥因子且數量高于正常，因此對于中重度干眼癥的患者還應進行抗炎癥治療[16-17]。

近年來，筆者采用鬼針草、槲寄生及密蒙花茶等藥物用于預防和治療去勢雄兔干眼癥并取得一定療效[18-22]，但對于長期用藥的副作用，筆者也正在跟蹤隨訪。而纖維蛋白膠羊膜棒，作為一種植入材料，可以較長時間存留并起到一定作用，很好的避免激素替代療法的副作用。

纖維蛋白膠羊膜棒治療干眼癥的機制相對來說較為明確，可以將纖維蛋白膠羊膜棒看作一種醫(yī)療器械和藥物的聯合體，植入羊膜棒進行淚道阻塞，抑制淚道上皮細胞鱗狀化生、變性，儲留淚液，減少免疫蛋白和離子成分的流失，提高防御能力，保護淚膜，增加淚膜的穩(wěn)定性，從而達到改善眼表微結構的目的。此外，纖維蛋白膠能很好地粘合淚道，短期內能很好地儲留淚液，對淚道上皮細胞還有一定的保護的作用，延長藥物作用時間，避免頻繁用藥帶來的副作用。

本實驗研究結果可以看出，纖維蛋白膠羊膜棒在預防和治療去勢雄兔干眼癥方面起到一定的作用，治療的效果更為顯著。C組在植入4～6周后可改善去勢雄兔SIT，證明淚道封閉后眼表的淚液量有所增加，使眼表刺激癥狀緩解，并且修復淚膜功能。而A、B組SIT出現惡化的現象。F組在治療2、4及6周后，SIT明顯升高。通過植入纖維蛋白膠羊膜棒，使得C、F組中炎癥細胞減少，基底細胞密度下降，抑制淚道黏膜上皮的異常增殖及過度分化，從而延緩干眼癥的進展。

綜上所述，對于去勢雄兔干眼癥，纖維蛋白膠羊膜棒能夠有效地明顯的改善干眼癥狀，操作方法安全簡便，藥物持續(xù)時間長，可吸收，具有廣泛的臨床應用前景，值得進一步推廣。

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Effect of fibrin glue amniotic rod on treatment of dry eye in models of castrated rabbit*

Ming-yang Ma1,Lei Ye1,Shuang-shuang Zhou2,Xue-xiang Zou2,Qi-chen Yang3,An-hua Wu2,Gang Tan2,Yi Shao1
(1.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China;2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of University of south china,Hengyang,Hunan 421001,China;3.Eye Institute of Xiamen University,Xiamen,Fujian 361102,China)

ObjectiveTo investigate the effect of fibrin glue amniotic rod on prevention and treatment of dry eye in models of castrated rabbit.MethodsA total of 60 castrated male rabbits (60 right eyes)were randomly divided into:group A (sham group),group B (sham plus fibrin glue amniotic rod for 5 seconds),group C (sham plus fibrin glue amniotic rod for 6 weeks),group D (dry eye),group E (dry eye plus fibrin glue amniotic rod for 5 seconds)and group F (dry eye plus fibrin glue amniotic rod for 6 weeks).Animals were observed for 6 weeks after surgery.Schirmer I test (SIT),Corneal fluorescein (FL),Immunofluorescentstaining on cornea and Western blot analysis of K16 expression were performed at baseline,2 weeks,4 weeks and 6 weeks after treatment.ResultsAs for group C,SIT showed beneficial effect of fibrin glue amniotic rod sensitively on the rates at each recording time after treatment when compared with those in the baseline(P＜0.05).Group C had a significant improvement in terms of SIT in comparison with group A and B at various time points(P＜0.05).Group C had a significant improvement in terms of FL in comparison with group A and B at the time point of 4 weeks and 6 weeks after treatment(P＜0.05).Group F experienced a dramatic amelioration of SIT and FL at the time point of 2 weeks,4 weeks,and 6 weeks after treatment(P＜0.05).Epithelial basal cells and inflammatory cells were significantly decreased in group C and F (P＜0.05),Immunofluorescent staining and Western blot showed downregulated expression of K16 in lacrimal mucosa in group C and F when compared with other groups(P＜0.05).ConclusionFibrin glue amniotic rod can prevent and treat dry eye in models of castrated rabbit.

fibrin glue amniotic rod;castrated male rabbits;dry eye

R771

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.001

1005-8982（2017）24-0001-06

2017-03-13

國家自然科學基金（No：81160118，81400372，81400424，81660158）；江西省遠航工程（No：2014022）；江西省自然科學基金重大項目（No：2016ACB21017）；江西省青年科學基金（No：20151BAB215016）；江西省科技支撐計劃項目（No：20151BBG70223）

邵毅，E-mail：freebee99@163.com

（王榮兵 編輯）