miR-148a對(duì)食管癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響及潛在分子機(jī)制研究

李張維，李濤

（西南醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

臨床研究·論著

miR-148a對(duì)食管癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響及潛在分子機(jī)制研究

李張維，李濤

（西南醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

目的探究微小核糖核酸148a（miR-148a）在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中的表達(dá)及對(duì)食管癌TE-1細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。方法收集48例食管癌患者腫瘤及癌旁組織的RNA標(biāo)本，逆轉(zhuǎn)錄PCR合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR檢測(cè)miR-148a在腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析腫瘤組織中miR-148a表達(dá)差異的臨床意義。將人工合成的miR-148a模擬物（miR-148a mimics）轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞TE-1中，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-148a對(duì)TE-1細(xì)胞遷移的影響，Transwell小室模型檢測(cè)miR-148a對(duì)TE-1侵襲的影響。Western blot檢測(cè)miR-148a過表達(dá)對(duì)TE-1細(xì)胞中原癌基因（c-myc）及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果MiR-148a在食管癌組織中表達(dá)水平下調(diào)（P=0.031）；過表達(dá)miR-148a能夠抑制 TE-1 細(xì)胞遷移（P=0.021）及侵襲（P=0.018）并下調(diào)細(xì)胞內(nèi) c-myc（P=0.037）及 MMP-9（P=0.026）的表達(dá)水平。結(jié)論miR-148a在食管癌中低表達(dá)，miR-148a可能通過抑制c-myc/MMP-9通路的表達(dá)來發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞遷移及侵襲。

MiR-148a；食管癌；遷移；侵襲；原癌基因（c-myc）；基質(zhì)金屬蛋白酶9

食管癌是我國(guó)常見的上消化道惡性腫瘤之一[1]，對(duì)于食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究對(duì)于提高食管癌患者的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)效果具有重要意義。MicroRNAs是一類長(zhǎng)度在25個(gè)核苷酸以內(nèi)的單鏈、短序列RNA。MicroRNAs不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，而是通過結(jié)合與靶基因mRNA的3’-端非編碼區(qū)（three prime untranslated region，3’-UTR）來抑制靶基因表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA 148a（miR-148a）的異常表達(dá)與卵巢癌[3]、肺癌[4]等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因而，miR-148a被認(rèn)為是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤評(píng)估指標(biāo)。但是miR-148a在食管癌中的表達(dá)及生物作用尚不完全清楚。本研究通過檢測(cè)miR-148a在食管癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞遷移侵襲的效應(yīng)，為食管癌的診治提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2014年3月-2015年4月于四川省腫瘤醫(yī)院收治的48例食管鱗狀細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織患者。其中，年齡45～68歲；男性34例，女性14例。所有入組患者均簽署研究知情同意書。人食管癌細(xì)胞系TE-1（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所），細(xì)胞液體培養(yǎng)基 DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）（購(gòu)自美國(guó) Gibco公司），Trizol試劑（15596026）及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）、一步法轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（10928042）（購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司），miR-148a mimics、陰性對(duì)照 mimics、miR-148a 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 引物試劑盒及 RNU6B qRT-PCR引物試劑盒（購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司），兔抗人原癌基因（c-myc）（#5605）及基質(zhì)金屬蛋白 酶 9 （matrix metalloproteinases 9，MMP-9）（#13667）多克隆抗體和小鼠抗人β-actin（#3700）單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（WBKLS0050）（購(gòu)自美國(guó)密理博公司），8.0μm 孔徑 Transwell小室（#3458）（購(gòu)自美國(guó)Corning公司），基質(zhì)膠（貨號(hào)：354230）（購(gòu)自美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 按Trizol試劑說明書提取組織或細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃ 30min，94℃ 2min，循環(huán) 1 次；94℃ 15s，60℃ 30s，68℃ 3min，循環(huán)次數(shù)40；72℃ 10min。以 RNU6B 作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-148a的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及mimics轉(zhuǎn)染 TE-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2、3代。按過夜增殖至愈合度達(dá)70%之密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×PBS溶液充分洗滌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：miR-148a組每孔加入100 pmol miR-148a mimics及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對(duì)照組每孔加入100 pmol的陰性對(duì)照mimics及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。添加無血清DMEM培養(yǎng)液至終體積1 ml/孔。4 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后的TE-1細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準(zhǔn)。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞4 h已減弱細(xì)胞間連接。100 μl的槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板內(nèi)殘余懸浮細(xì)胞，每孔加入2ml無血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.4 Transwell侵襲小室檢測(cè) 按1∶8比例采用DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，每孔100μl包被Transwell小室膜的上室面，取轉(zhuǎn)染72h后的TE-1細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105個(gè)/ml，上層小室每室加入250 μl細(xì)胞懸液，下層小室中加入含10%FBS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽擦凈上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室面細(xì)胞，Giemsa染液染色。×100光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)下室面的細(xì)胞個(gè)數(shù)。以每個(gè)小室的平均細(xì)胞數(shù)為最終計(jì)數(shù)。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)染72 h后的TE-1細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%BSA室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的c-myc、MMP-9及β-actin抗體。在4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，ECL法發(fā)光觀察蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a在食管癌組織中的表達(dá)

在對(duì)48組食管癌癌及癌旁組織中進(jìn)行PCR定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.475±0.013）。結(jié)果表明，其表達(dá)水平較癌旁組織（1.136±0.011）降低（t=2.307，P=0.031）。以 48例食管癌組織中miR-148a的平均表達(dá)量為界值，將患者分為miR-148a高表達(dá)組（≥0.475，n=35）及miR-148a低表達(dá)組（＜0.475，n=13）。對(duì)兩組患者的臨床病理特征進(jìn)行分析表明，食管癌組織中miR-148a陽性表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=6.553，P=0.019）關(guān)系密切。見附表。

附表 食管癌患者miR-148a與臨床特征表達(dá)的關(guān)系

2.2 過表達(dá)miR-148a表達(dá)對(duì)TE-1遷移及侵襲的影響

為探究miR-148a的生物學(xué)功能，筆者首先通過mimics轉(zhuǎn)染在TE-1細(xì)胞內(nèi)成功過表達(dá)miR-148a（t=17.291，P=0.003）（見圖 1A）。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics組（33.430±4.356）比較，過表達(dá)miR-148a能抑制TE-1細(xì)胞遷移（51.283±7.201）（t=6.833，P=0.021）（見圖 1B）。Transwell侵襲小室檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照mimics比較（89.685±9.375），miR-148a對(duì) TE-1細(xì)胞的侵襲能力（27.094±6.281）同樣具有抑制效果（t=7.124，P=0.018），見圖 1C。

圖1 過表達(dá)miR-148a抑制TE-1細(xì)胞遷移及侵襲

2.3 過表達(dá)miR-148a抑制TE-1細(xì)胞內(nèi)c-myc及MMP-9的表達(dá)

生物信息學(xué)檢索表明，癌性轉(zhuǎn)錄因子c-myc是miR-148a的下游潛在作用靶點(diǎn)（見圖2A）。筆者在TE細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-148a后，通過蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白的表達(dá)下調(diào)（0.623±0.074 vs 0.466±0.101，t=5.307，P=0.037）（見圖 2B）。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲具有重要促進(jìn)作用的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)量也降低（0.760±0.111 vs 0.512±0.109，t=6.113，P=0.026）。

圖2 過表達(dá)miR-148a抑制TE-1細(xì)胞內(nèi)c-myc及MMP-9表達(dá)

3 討論

目前，在臨床上有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的食管癌的生物學(xué)診斷標(biāo)志物及治療靶極少[5]。因而，研究新的食管癌生物治療靶點(diǎn)靶標(biāo)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。miR-148a由位于染色體7p15.2上的基因編碼[6]。研究確認(rèn)，miR-148a在生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用。例如，前B淋巴細(xì)胞激活后能誘導(dǎo)miR-148的表達(dá)，miR-148a進(jìn)而誘導(dǎo)活化的B淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化成漿細(xì)胞，即效應(yīng)B淋巴細(xì)胞[7]。除此之外，miR-148a在骨骼肌細(xì)胞分化的過程中同樣具有誘導(dǎo)作用[8]。近年來對(duì)miR-148a功能的研究多集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域。在胃癌組織及多種胃癌細(xì)胞系中均檢測(cè)到miR-148a的表達(dá)下調(diào)[9]。低表達(dá)的miR-148a與患者腫瘤體積增大、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM臨床分期[10]及不良預(yù)后均密切相關(guān)[11]。提示miR-148a在癌組織中的低表達(dá)，并具有相當(dāng)?shù)呐R床意義。在本研究中，筆者通過對(duì)食管癌及癌旁組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中的表達(dá)明顯降低，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的惡性表型關(guān)系密切，提示miR-148a可能通過抑制食管癌細(xì)胞侵襲而抑制腫瘤發(fā)展。

本研究中，筆者通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)提高食管癌TE-1細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)，通過細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)和Transwell侵襲小室模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-148a能夠明顯抑制TE-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。該研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外學(xué)者在腎癌[12]、乳腺癌[13]及卵巢癌[14]中的研究結(jié)論相一致。為探討miR-148a的作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)，癌性轉(zhuǎn)錄因子c-myc可能是miR-148a的作用靶點(diǎn)之一。通過蛋白免疫印跡檢測(cè)，證實(shí)miR-148a對(duì)c-myc表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用。并且c-myc轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)MMP-9的表達(dá)水平也受到明顯的抑制。MMP-9是參與分解細(xì)胞外機(jī)制而促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲的蛋白酶之一[15]，其表達(dá)改變從分子水平解釋了過表達(dá)miR-148a后細(xì)胞遷移及侵襲能力變化的原因。

綜上所述，miR-148a在食管癌中表達(dá)下調(diào)并與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)表型關(guān)系密切。在體外，miR-148a夠通過抑制c-myc/MMP-9的表達(dá)來抑制食管癌細(xì)胞的遷移侵襲能力，最終抑制食管癌進(jìn)展。

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Role and potential mechanism of miR-148a in migration and invasion of esophageal carcinoma

Zhang-wei Li,Tao Li
(School of Clinical Medicine,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-148a in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its role in cell migration and invasion.MethodsA total of 48 cases of ESCC and tumor adjacent tissue ribonucleic acid (RNA)samples were collected in our hospital.Complementary deoxyribonucleic acid(cDNA)was synthetized by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The expression level of miR-148a was detected by real-time PCR.MiR-148a mimics were synthesized and transfected into TE-1 cells.Migration and invasion rates were determined by wound-healing assay and Transwell assay,respectively.The expression levels of c-myc and matrix metalloprotein 9(MMP-9)were measured by Western blot.ResultsmiR-148a was down-regulated in ESCC tissue(P=0.031).Over-expression of miR-148a inhibited migration and invasion rates of TE-1 cells(P=0.021 and 0.018,respectively).Moreover,protein levels of c-myc and MMP-9 were decreased with miR-148a over expression(P=0.037 and 0.026,respectively).ConclusionsmiR-148a inhibits cell migration and invasion of ESCC through inhibition of c-myc/MMP-9 signal pathway.

miR-148a;esophageal cancer;migration;invasion;c-myc;matrix metalloproteinases 9

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.006

1005-8982（2017）24-0029-05

2017-02-28

李濤，Tel：13709000298

（王榮兵 編輯）