劉淑艷 王芳 王建宇 林榕姍

（1. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，大連 116015；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018）

根皮苷降解真菌的篩選、鑒定及降解特性研究

劉淑艷1王芳2王建宇2林榕姍2

（1. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，大連 116015；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018）

篩選高效降解根皮苷的功能菌以期為生物降解根皮苷、緩解蘋果連作障礙奠定基礎(chǔ)。采用以根皮苷為唯一碳源選擇性培養(yǎng)基篩選菌種，對篩選的菌種進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并研究了不同培養(yǎng)條件下的降解特性。結(jié)果顯示，從環(huán)渤海蘋果主產(chǎn)區(qū)的12個(gè)縣市地區(qū)的蘋果根際土壤中篩選出一株能夠高效降解根皮苷的菌株AMCC300110，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法初步鑒定該菌為土曲霉（Aspergillus terreus），該菌在根皮苷初始濃度為2 mmol/L、pH5.0，接種量2%條件下，40℃、160 r/min搖床培養(yǎng)96 h，降解率可達(dá)88.96%。降解特性研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，該菌分別在pH為5.0，培養(yǎng)溫度40℃，初始根皮苷濃度為6 mmol/L時(shí)有最大的降解率，同時(shí)該菌還具有廣譜降解酚酸的能力。通過選擇性培養(yǎng)基篩選得到一株土曲霉，該菌具有高效降解根皮苷的能力，在生物降解酚酸類自毒物質(zhì)，緩解蘋果連作障礙方面有一定的應(yīng)用潛力。

根皮苷；生物降解；連作障礙；土曲霉

研究發(fā)現(xiàn)，由蘋果根系分泌的酚酸類自毒物質(zhì)也是引起連作障礙的重要原因［3］。根皮苷（Phloridzin）的分子式為C21H24O10，是蘋果所特有的酚酸類物質(zhì)，它主要存在于蘋果的根、莖、皮、嫩葉和果實(shí)中，有研究證實(shí)高濃度的根皮苷可以抑制蘋果幼苗的生長，使植株光合速率和蒸騰速率降低［4］。此外，根皮苷作為葉綠體中一種光合磷酸化和磷酸化偶聯(lián)電子傳遞的的特異性抑制劑，能夠抑制蘋果根系TCA循環(huán)檸檬酸合酶（CS）、蘋果酸脫氫酶（MDH）等7種酶活性，是造成蘋果連作障礙的重要的酚酸類自毒物質(zhì)之一［5］。

利用微生物降解的方法是降低環(huán)境中根皮苷含量，緩解蘋果連作障礙的有效途徑。微生物降解具有經(jīng)濟(jì)、高效且無二次污染等特點(diǎn)逐漸受到人們的重視［6］。目前，研究人員雖然針對酚酸類化合物的生物降解展開了一系列的工作，如丁香酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸等，但針對根皮苷的生物降解研究較少，特別是根皮苷的高效降解菌更為稀少［7］。因此，篩選根皮苷高效降解菌，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。本研究從環(huán)渤海地區(qū)12個(gè)縣市地區(qū)的蘋果主產(chǎn)區(qū)取樣，篩選分離根皮苷的高效降解菌，分析其降解特性，為根皮苷的生物降解、緩解蘋果連作障礙提供資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采集自環(huán)渤海灣蘋果主產(chǎn)區(qū)的蘋果根際土，包括山東的昌邑、棲霞、蓬萊，遼寧綏中、瓦房店、錦州，河北的昌黎、撫寧、青縣等12個(gè)地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（10 mmol/L）：根皮苷4.8 g，磷酸二氫 1 g，氯化鉀 0.2 g，硫酸鎂 0.2 g，蒸餾水 1 L，pH7.0，于 121℃滅菌 20 min；分離培養(yǎng) 基（2 mmol/L）：根 皮 苷 0.96 g，NH4H2PO41g，KCl 0.2 g，MgSO40.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.0；若為固體培養(yǎng)基，則添加20 g瓊脂，于 121℃滅菌20 min；查氏瓊脂（CA）：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g， 蔗 糖 30 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，于 121℃滅菌 20 min；查氏酵母膏瓊脂（CYA）：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，酵母膏 5 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，于 121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 根皮苷降解真菌的馴化、富集 取蘋果樹根際土壤 1 g，分別裝入 100 mL 10 mmol/L 根皮苷液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min 培養(yǎng) 5 d；再取 1 mL培養(yǎng)液加入到另一新的 100 mL 10 mmol/L根皮苷液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min 培養(yǎng)5 d，如此重復(fù)3次。

1.2.2 根皮苷降解真菌的分離純化 取富集培養(yǎng)液1 mL 加入到 99 mL 無菌水中，充分混勻，按照梯度稀釋法稀釋至10-7；然后用無菌移液槍分別吸取0.1mL上述稀釋液于已經(jīng)冷凝好的2 mmol/L 根皮苷固體培養(yǎng)基平板中，用涂布棒涂抹均勻，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板，放在 30℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察菌的生長情況，分離并純化固體平板上的真菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將真菌菌株點(diǎn)種查氏瓊脂（CA）和查氏酵母膏瓊脂（CYA）培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后用棉蘭染色在低倍鏡下觀察菌絲體和孢子特征，依據(jù)菌落特征和個(gè)體形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定。同時(shí)利用掃描電鏡拍攝電鏡照片。分子生物學(xué)鑒定：采用OMEGA真菌試劑盒提取菌體總DNA，所用引物參照NY/T 1736-2009 ITS1和ITS4序列，目的片段大小400-700 bp。擴(kuò)增體系為50 μL ：DNA 模板 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Mg2+buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L each）4 μL，ITS1 2μL，ITS2 2 μL，Taq 酶 2 μL，ddH2O 27 μL ；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 50 s，50℃退火1 min，72℃延伸 1.5 min；共34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將測序獲得的序列在NCBI進(jìn)行比對。

1.2.4 降解特性研究

1.2.4.1 孢子懸浮液的制備 將真菌接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)3-5 d，待孢子成熟后用2 mmol/L的根皮苷液體培養(yǎng)基沖洗平板，用6-8層無菌紗布過濾除去菌絲體，用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配制成密度約2.2×107CFU/mL的孢子懸浮液。

1.2.4.2 pH培養(yǎng)基對降解率影響 按照2%的接種量將孢子懸浮液分別接入到50 mL、2 mmol/L的pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的根皮苷液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)4 d，測定菌體生長量和根皮苷降解率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.4.3 培養(yǎng)溫度對根皮苷降解率的影響 按照2%的接種量將孢子懸浮液接入50 mL、2 mmol/L、pH5.0的根皮苷液體培養(yǎng)基中，分別置于溫度為25、30、35、40和45℃的搖床中160 r/min培養(yǎng)4 d，測定菌體生長量和根皮苷的降解率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.4.4 根皮苷初始濃度對降解率的影響 按照2%的接種量將孢子懸浮液分別接入50 mL、pH5.0的初始濃度分別為2、4、6、8和10 mmol/L的根皮苷液體培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)4 d，測定菌體生長量和根皮苷降解率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.4.5 降解譜的研究 將2 mmol/L的根皮苷液體培養(yǎng)基中的根皮苷分別換成2 mmol/L的綠原酸、間苯三酚、焦性沒食子酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸九種不同的酚酸，按照2%的接種量將孢子懸浮液接入到50 mL的液體培養(yǎng)基中，放入到30℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)4 d，觀察菌體的生長情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 菌種篩選

以根皮苷為唯一碳源進(jìn)行初篩，從12個(gè)縣市區(qū)的蘋果根際土壤樣品中共獲得44株能夠利用根皮苷生長的真菌。根據(jù)菌落大小判定各真菌利用根皮苷的能力，其中編號(hào)為AMCC300110真菌利用根皮苷的能力最強(qiáng)，其菌落直徑可達(dá)8.2 cm。

2.2 菌種鑒定

AMCC300110在查氏培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)40-45 mm，質(zhì)地絲絨狀，有放射狀溝紋，中央部分稍凸起，初為白色，48-72 h后變成黃色；背面為淡黃色（圖1-A，1-B）。該菌在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上直徑大約70-80 mm邊緣白色，約3-5 mm，質(zhì)地絲絨狀，有放射狀溝紋，中央部分稍凸起，菌落正面淡黃色反面為褐色（圖1-C，1-D）。

鏡檢發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，由氣生菌絲分化出的分生孢子梗直立，頂端膨大成球形，其上產(chǎn)生成串的分生孢子，分生孢子頭的頂囊球形或“近球形”，小梗雙層，呈放射狀排列，頂端有鏈形孢子（圖1-E，1-F）。

表1 培養(yǎng)5 d部分降解真菌菌落大小

圖1 AMCC300110菌株形態(tài)特征

擴(kuò)增所得該菌的ITS序列，PCR產(chǎn)物長度約700 bp，在NCBI上進(jìn)行比對分析，菌株AMCC300-110與土曲霉序列相似性為99%，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，可將該菌初步鑒定為土曲霉（Aspergillus terreus）。

2.3 降解特性

2.3.1 pH培養(yǎng)基對降解率影響 如圖2所示，菌株AMCC300110在pH4.5-7.0之間均能生長，其中在pH5.0處有最大生長量，對根皮苷的降解也達(dá)到最大值，可達(dá)到83.04%，隨著pH的不斷增大，其菌體生長量和根皮苷的降解率不斷下降。

圖2 初始pH對菌體生長及根皮苷降解率的影響

2.3.2 培養(yǎng)溫度對根皮苷降解率的影響 該菌株在25-40℃時(shí)菌體量隨溫度升高而增多且降解率也隨溫度升高而升高，該菌在40℃時(shí)降解率最高，可達(dá)98.96%，隨著溫度的進(jìn)一步升高，當(dāng)?shù)竭_(dá)45℃時(shí)，其菌體生物量顯著降低，根皮苷的降解率僅為56.47%（圖3）。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌體生長及根皮苷降解率的影響

2.3.3 根皮苷初始濃度對根皮苷降解率的影響 由圖4可以看出，不同根皮苷初始濃度下，根皮苷的降解率和菌體生長量有顯著差異。隨著根皮苷濃度的逐漸增加，該菌在根皮苷初始濃度為6 mmol/L時(shí)的降解率最高，達(dá)到89.15%，但當(dāng)增加至10 mmol/L時(shí)，其降解率和菌體量明顯降低，且菌體生長量和根皮苷降解率之間呈正相關(guān)趨勢。

圖4 根皮苷初始濃度對于菌體生長及根皮苷降解率的影響

2.3.4 降解譜研究 該菌可以利用以下10種酚酸為唯一碳源進(jìn)行生長（表2）。它在以對羥基苯甲酸和焦性沒食子酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中長勢最好。而該菌在肉桂酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中長勢最弱。由于酚酸的降解率與菌體生長量之間呈正相關(guān)趨勢，因此初步認(rèn)為該菌對對羥基苯甲酸和焦性沒食子酸的降解率最高而對肉桂酸的降解率最低。

表2 菌在不同酚酸中的生長情況

3 討論

中國蘋果種植面積超過200萬hm2，其中 90%以上的樹齡在20年以上，受土地資源限制，蘋果產(chǎn)區(qū)老果園更新面臨連作障礙，該問題已成為果園更新和蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸［15］。連作條件下，蘋果植株往往表現(xiàn)出生物量降低、干物質(zhì)的積累量減少、產(chǎn)量降低、樹勢衰退等。引起連作障礙的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，由植物分泌產(chǎn)生的酚酸類自毒物質(zhì)是其中的重要因素，根皮苷作為蘋果所特有的酚酸類物質(zhì)也是引起連作障礙的重要原因之一［16］。利用微生物降解法降解環(huán)境中的酚酸類物質(zhì)越來越受到人們的青睞，其優(yōu)點(diǎn)在于費(fèi)用低、降解高效、不產(chǎn)生副作用、修復(fù)徹底等，是一類低耗高效和環(huán)境安全的修復(fù)技術(shù)，而篩選高效降解酚酸類物質(zhì)的菌株稱為該項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［17］。本研究通過對環(huán)渤海一帶的果園土壤進(jìn)行富集培養(yǎng)，篩選出44株能夠以根皮苷為唯一碳源生長的真菌，其中，以AMCC300110菌株生長情況和利用根皮苷的能力最強(qiáng)，該菌在2 mmol/L的根皮苷篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落直徑可達(dá)8.2 cm，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法初步鑒定該菌為土曲霉。研究特性結(jié)果表明，該菌分別在pH5.0、培養(yǎng)溫度40℃、根皮苷初始濃度為6 mmol/L時(shí)有最大降解率，原因可能是在該培養(yǎng)條件下適合菌體的生長或是菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)分別在此培養(yǎng)條件下活性最高，因此，研究探索該菌產(chǎn)生何種活性物質(zhì)以及活性物質(zhì)有何理化性質(zhì)是下一步工作的重點(diǎn)。環(huán)境中酚酸類自毒物質(zhì)往往以混合物形式存在，研究發(fā)現(xiàn)，該菌能夠利用包括對羥基苯甲酸等在內(nèi)的10種酚酸，表現(xiàn)出廣譜降解酚酸的能力，具有一定的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

以環(huán)渤海灣蘋果主產(chǎn)區(qū)的蘋果根際土為研究對象，以根皮苷唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)和分離篩選真菌菌種，獲得了一株能夠高效降解根皮苷的土曲霉，編號(hào)為AMCC300110。同時(shí)，該菌還具有廣譜降解酚酸的能力，為生物降解酚酸類物質(zhì)，緩解蘋果連作障礙提供了科學(xué)依據(jù)，積累了寶貴的資源。

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Isolation，Identification and Degrading Properties of Phlorizin-Degrading Fungi

LIU Shu-yan1WANG Fang2WANG Jian-yu2LIN Rong-shan2
（1. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116015；2. Shan Dong Agricultural University，Taian 271018）

Screening highly efficient phlorizin-degrading microorganism is important for bioremediation of phlorizin-contaminated environment. This study aimed to isolate and identify high efficient phlorizin-degrading microorganism from the rhizosphere soils of apple，then to characterize degrading properties of target strains. Phlorizin-degrading microorganism were screened by the plate-culture method，used phloridzin as the sole carbon sources，and then the target strains were identified by the morphological and molecular methods. Degrading properties of phlorizin -degrading microorganism were determined under different condition of culture. The results showed that a phlorizindegrading fungal strain AMCC300100 identified as Aspergillus terreus were obtained from the rhizosphere soils of apple replantd and nonreplanted orchards surrounding Bohai gulf area. The phlorizin degradation rate of the strain AMCC300100 has reached 88.96%（phlorizin initial concentration of 2 mmol/L，pH5.0，2% inoculum）cultured 96h under the conditions of 40℃，160r/min；The strain AMCC300110 have high-efficient degradation ability not only for phlorizim but also for the other phenolic acids. Though plate-culture method，We obtained a fungal strain identified as Aspergillus terreus，this fungal strain have high-efficient degradation ability for phlorizim，and have tremendous potential in solving apple replant disease.

phlorizin；biodegradation；replant disease；Aspergillus terreus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0536

蘋果連作障礙（Apple replant disease）是指隨著蘋果樹種植年限的加長，導(dǎo)致新栽蘋果幼樹表現(xiàn)出生長衰弱、樹冠小、根系發(fā)育不良、腐爛、甚至早期死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)，給生產(chǎn)帶來了巨大的危害和損失［1］。造成連作障礙的原因有很多，包括土壤理化性質(zhì)的惡化，根際微生物區(qū)系的改變等［2］。

2017-06-29

國家“948”重點(diǎn)項(xiàng)目（2011-G30），國家質(zhì)檢公益課題（201310230），產(chǎn)毒真菌分子生物學(xué)快速檢測體系的建立（2010IK131），“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（SQ2017ZY060105-06）

劉淑艷，女，博士，研究方向：食品微生物學(xué)及分子生物學(xué)；E-mail：Liusy@lnciq.gov.cn

林榕姍，女，博士，副教授，研究方向：資源與環(huán)境微生物；E-mail：lrs2680@163.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）