馬永松 李琋 李珍珍 王佩潔

（西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，成都 610500）

一株鎳抗性和石油烴降解菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性

馬永松 李琋 李珍珍 王佩潔

（西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，成都 610500）

從四川省長(zhǎng)寧-威遠(yuǎn)地區(qū)頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)重度污染區(qū)的土壤中，篩選出一株鎳抗性和石油高效降解菌株，研究其生物學(xué)特性和部分生理生化指標(biāo)。將種子液接種在原油重金屬液體培養(yǎng)基中，30℃、130 r/min條件下分別培養(yǎng)7 d探究該菌株對(duì)金屬鎳離子的抗性和對(duì)總石油烴（Total petroleum hydrocarbon，TPH）的降解率，以及經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)、形態(tài)觀察和16S rDNA對(duì)該菌株鑒定分析。結(jié)果顯示，該菌株對(duì)Ni2+的耐受性可達(dá)300 mg/L，對(duì)Ni2+的去除率和吸附率分別達(dá)到了56.64%和52.16%，同時(shí)對(duì)總TPH的降解率達(dá)到35.65%。確定該菌種屬檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.），命名為Citrobacter farmeri strain M1。該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH范圍為7-9，最適C∶N為10∶1和鹽最高耐受度可達(dá)5%。該菌株有較好的石油降解能力并對(duì)金屬鎳有較強(qiáng)的抗性，適用于石油重金屬混合污染土壤的修復(fù)。

石油降解菌；鎳抗性；分離鑒定；生物學(xué)特性

本研究從四川省長(zhǎng)寧-威遠(yuǎn)地區(qū)頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)重度污染區(qū)的含油土壤中篩選出了一株對(duì)鎳和石油具有復(fù)合抗性和降解的菌株，鑒定其菌屬，測(cè)定了其一部分的生物學(xué)特性，并研究了它對(duì)鎳和石油的去除效果，為后來(lái)以該菌株為生物修復(fù)劑，對(duì)石油-重金屬混合污染土壤的微生物修復(fù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 含油污泥 含油污泥樣品來(lái)源于四川省長(zhǎng)寧-威遠(yuǎn)地區(qū)頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)內(nèi)部重度污染區(qū)，油泥的主要成分為有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽、油類和重金屬，含油量在100 000 mg/kg以上和重金屬含量為210 mg/kg左右，采用對(duì)角線法，采取10份土壤混合均勻后的土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 富集篩選培養(yǎng)基 富集篩選培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2-7.4，1×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.2 原油重金屬液體培養(yǎng)基 原油重金屬液體培養(yǎng)基主要成分為原油（原油取自遼河油田，組成為：飽和烴：35.32%，芳香烴：23.17%，膠質(zhì)-瀝青質(zhì)：41.51%）10 g/L，酵母粉3 g /L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH為7.2-7.4，加入一定濃度的重金屬Ni2+溶液，使最終Ni2+濃度為300 mg/L，1×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.3 原油重金屬固體培養(yǎng)基 原油重金屬固體培養(yǎng)基主要成分為在相應(yīng)的原油重金屬液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂［17］。

1.1.2.4 基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基 基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基的主要成分：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，調(diào)節(jié) pH 為 7.2-7.4，1×105Pa 滅菌 30 min［19］。

1.2 方法

1.2.1 鎳抗性和石油降解菌的分離和篩選 稱取新鮮土樣10 g，加入到90 mL的無(wú)菌水中，在室溫下振蕩30 min，制備成土懸液，然后用移液槍吸取1mL所需濃度的菌懸液，注入到富集培養(yǎng)基內(nèi)并置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2 d，用肉眼觀察培養(yǎng)基內(nèi)是否有菌生長(zhǎng)。取富集樣品1 mL，接種于原油重金屬液體培養(yǎng)基中，在30℃、130 r/min的搖床上培養(yǎng)72 h，再取培養(yǎng)液1 mL進(jìn)行傳代馴化。每72 h接種傳代一次，經(jīng)過(guò)5次石油重金屬液體培養(yǎng)基馴化后，蘸取馴化菌液于培養(yǎng)皿上涂布分離，30℃培養(yǎng)48-72 h，觀察菌體的生長(zhǎng)情況，挑選生長(zhǎng)優(yōu)良的菌落經(jīng)過(guò)多次純化后，將單菌落再次接種于石油重金屬液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在30℃下，130 r/min的搖床上培養(yǎng)［20-22］。經(jīng)過(guò)復(fù)篩后，淘汰去除石油和重金屬能力較低的菌株，最終篩出抗鎳（300 mg/L）和具有石油降解能力的菌株，共計(jì)7株（編號(hào)M1-M7），并從這7株菌株中篩選出一株對(duì)鎳和石油烴去除能力較高的菌株接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30℃下進(jìn)行增殖培養(yǎng)為種子液，作為鑒定和生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)的供試菌株。

1.2.2 菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)的觀察 在原油重金屬固體培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)、邊緣、顏色和透明度等［23］。并采用掃描電鏡（SEM）對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行大小和形態(tài)的觀察［24］。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn) 甲基紅實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、脂酶實(shí)驗(yàn)、酪蛋白水解實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)和動(dòng)力實(shí)驗(yàn)等方法見參考文獻(xiàn)［19］。

1.2.4 供試菌株對(duì)石油的降解和對(duì)鎳的去除及吸附實(shí)驗(yàn) 將供試菌株接種在擴(kuò)大培養(yǎng)基中培養(yǎng)為種子液。吸取0.5 mL加入到含Ni2+濃度為300 mg/L的50 mL的擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30℃恒溫震蕩（130 r/min）培養(yǎng) 72 h［25-26］。8 000 r/min 離心 10 min，將上清液和菌體沉淀完全分開，取0.5 g上清液通過(guò)消解，采用原子吸收分光光度法測(cè)定鎳的含量。將剩下的菌體沉淀取0.5 g，通過(guò)采用鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解法預(yù)處理后，用原子吸收分光光度法測(cè)定鎳的含量，計(jì)算鎳的去除率和吸附率［27］。再吸取0.5mL加入到50 mL原油液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫震蕩（130 r/min）培養(yǎng)7 d，采用超聲萃取-紫外分光光度法測(cè)定培養(yǎng)基中石油含量，計(jì)算降解率。計(jì)算去除率、吸附率和降解率公式如下：

1.2.5 菌株16S rDNA的序列分析

1.2.5.1 核酸提取 菌株在基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期的菌液于裝有1mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中，洗滌一次，用生工生物工程（上海）股份有限公司細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取基因組總的DNA。

1.2.5.2 PCR反應(yīng) 引物設(shè)計(jì)來(lái)自文獻(xiàn)［28］：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10 min后降溫至16℃。

PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)得的基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST比對(duì)，進(jìn)行序列同源性分析。

1.2.6 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 取種子液1 mL接種于50 mL的基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基中（pH為7.2-7.4）分別置于下列培養(yǎng)條件下震蕩（130 r/min）培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定OD600值。設(shè)置溫度的梯度為15、20、25、27.5、30、35和37.5℃。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液初始pH至5、6、7、8、9、10和11。用葡萄糖和硝酸鉀作為碳源和氮源調(diào)節(jié) C:N［29］為 2∶1、5∶1、7∶1、10∶1、12∶1、15∶1和17∶1。設(shè)置NaCl濃度為1%、2%、3%、5%、7%、9%和11%。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 菌株生長(zhǎng)特性研究

1.2.7.1 菌株的生長(zhǎng)曲線 取供試菌株接種于100 mL的基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30℃在0-72 h周期里，間隔2 h取樣，測(cè)定OD600值。

1.2.7.2 污染物濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 分別配制下列不同污染物濃度的基礎(chǔ)擴(kuò)大培養(yǎng)基中（pH為7.2-7.4），向每瓶接種1 mL種子液，30℃下培養(yǎng)0、2、3、4、5、7、10、18、30和48 h取樣測(cè)定OD600值。Ni2+濃度分別為150、200、250、300和350 mg/L。原油濃度分別為2.5、5、7.5、10和12.5 g/L。原油和重金屬混合濃度分別為2.5和0.15、2.5和0.2、2.5和0.25、2.5和0.3、2.5和0.35 g/L。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株對(duì)石油降解和鎳的去除及吸附實(shí)驗(yàn)

由圖1-A可知，在初篩時(shí)篩選出的7株菌株中，M1和M3菌株對(duì)鎳有較好的吸附和去除效果，當(dāng)Ni2+的濃度為300 mg/L時(shí)，M1菌株對(duì)鎳的去除率和吸附率分別達(dá)到了56.64%和52.16%，M3對(duì)鎳的去除率和吸附率分別為58.07%和54.76%。由圖1-B可知，當(dāng)總石油烴的濃度為10 g/L時(shí)，M1菌株對(duì)石油烴的去除率到達(dá)35.7%，而M3對(duì)石油烴的去除率只有16.4%。

圖1 鎳抗性和石油降解菌株對(duì)鎳的去除率及吸附率（A）及菌株對(duì)總石油烴的降解率（B）

2.2 菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

通過(guò)對(duì)菌株菌落的形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）得出，該菌株的菌落形態(tài)為圓形且濕潤(rùn)、其顏色為淡黃色、邊緣規(guī)整、頂部凸起且透明度較差；從圖2可以看出細(xì)胞呈桿狀，表面略顯粗糙，直徑約0.6 μm，長(zhǎng)約1.1-1.8 μm。此外，M.R實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)及檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性（記為“+”）。革蘭氏染色、V-P實(shí)驗(yàn)、脂酶實(shí)驗(yàn)及酪蛋白水解實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)和動(dòng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性（記為“-”）。從生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述菌株生理生化結(jié)果與檸檬酸桿菌屬相一致，初步鑒定為檸檬酸桿菌屬。

圖2 菌株細(xì)胞掃描電鏡圖片

2.3 供試菌株16S rDNA的序列分析

為進(jìn)一步確定菌株的種屬關(guān)系，通過(guò)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取了M1基因組的DNA，并以27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'為PCR上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約1 407 pb的條帶并測(cè)序。序列結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行Blastn相似性分析發(fā)現(xiàn)，上述菌株與檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.）的16S rDNA序列的同源性均達(dá)到了98.7%以上，上述菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，從進(jìn)化距離分析發(fā)現(xiàn)與法氏檸檬酸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)模式菌株接近，因此將它鑒定為法氏檸檬酸桿菌，命名為Citrobacter farmeri strain M1。

表2 菌株形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

由圖4-A可以看出，該菌株最適宜的培養(yǎng)溫度在27.5℃和32℃之間。在30℃之前，隨著溫度的升高菌株的生長(zhǎng)速率升高，超過(guò)30℃菌株的生長(zhǎng)速率降低；由圖4-B可以看出，該菌株的最適pH在9左右；如圖4-C所示，該菌株最適的C∶N為10∶1；由圖4-D可以看出，該菌株隨著鹽濃度的增大，菌株的生長(zhǎng)速率受到抑制，當(dāng)鹽濃度超過(guò)5%生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)達(dá)到11%時(shí)基本不能正常生長(zhǎng)。

圖3 菌株M1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株生長(zhǎng)曲線

由圖5所示，該菌株在生長(zhǎng)了2 h時(shí)的OD600值為0.08左右，在培養(yǎng)了2-16 h后，OD600迅速上升，達(dá)到了2.0左右，說(shuō)明該菌株在接種0-2 h內(nèi)處于延遲期；在2-16 h內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在培養(yǎng)至16-50 h間，OD600值變化不大，說(shuō)明這時(shí)進(jìn)入了生長(zhǎng)的穩(wěn)定期；50 h之后，OD600值開始減小，說(shuō)明此時(shí)該菌株的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。以上結(jié)果說(shuō)明該菌株生長(zhǎng)速度快，適用于石油和重金屬?gòu)?fù)合污染土壤的修復(fù)。

2.6 Ni2+和石油濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.6.1 Ni2+濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖6可知，在菌株的生長(zhǎng)前期0-4 h，Ni2+濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響較小，但是4-10 h內(nèi)Ni2+的存在對(duì)菌株的生長(zhǎng)抑制較強(qiáng)，隨著對(duì)數(shù)期的到來(lái)，菌株才恢復(fù)了正常生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)基內(nèi)Ni2+濃度的升高，菌株的生長(zhǎng)提前進(jìn)入穩(wěn)定期，當(dāng)Ni2+濃度為300 mg/L時(shí)，菌株在培養(yǎng)10 h后直接進(jìn)入穩(wěn)定期緩慢生長(zhǎng)，沒有明顯的對(duì)數(shù)期出現(xiàn)。而當(dāng)Ni2+濃度為100 mg/L時(shí)，菌株在培養(yǎng)至7 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h后才開始進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)期持續(xù)了13 h左右。

2.6.2 石油濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖7可知，從其在含原油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)的OD600值和其生長(zhǎng)曲線比較可以看出，該菌株的生長(zhǎng)均隨著培養(yǎng)基中原油質(zhì)量濃度的升高而受到不同的抑制。在原油質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)，供試菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，提前4 h 進(jìn)入最高生長(zhǎng)量期，但當(dāng)原油的質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)，其生長(zhǎng)能力相對(duì)的有所下降。

2.6.3 石油和Ni2+混合濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖8可知，當(dāng)液體培養(yǎng)基同時(shí)添加不同量的Ni2+和原油后，菌株生長(zhǎng)受到抑制。在原油濃度2.5 g/L時(shí)，當(dāng)Ni2+濃度超過(guò)0.25 g/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制。

圖4 培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖5 菌株生長(zhǎng)曲線

圖6 Ni2+濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

3 討論

3.1 抗性菌株對(duì)石油和鎳的去除及吸附實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)菌株M1和M3對(duì)石油和鎳去除和吸附實(shí)驗(yàn)，對(duì)石油主要通過(guò)降解作用從而達(dá)到對(duì)石油的去除。對(duì)鎳的吸附和去除率觀察得到相差不大，由此可見，細(xì)菌對(duì)重金屬主要通過(guò)吸附和通過(guò)一系列的活動(dòng)使重金屬鎳改變價(jià)態(tài)，使其生成磷酸鹽沉淀而達(dá)到去除的作用［30］。利用微生物處理石油-重金屬混合污染土壤的實(shí)際應(yīng)用中，所用菌株對(duì)金屬離子有較高的抗性和石油污染物有較好的降解效果，那么該菌株在污染土壤中往往具有較高的存活率，其處理污染土壤的效率也就越強(qiáng)［31-33］。綜合比較選取M1作為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)菌株。

圖7 石油濃度分別對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖8 石油和Ni2+混合濃度（g/L）對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

3.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

溫度是通過(guò)影響蛋白質(zhì)、核酸等大分子的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝。溫度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)影響微生物的活性和代謝能力。不同微生物的生長(zhǎng)繁殖要求的最適溫度不同，根據(jù)微生物生長(zhǎng)的最適溫度范圍，可分為高溫菌、中溫菌和低溫菌。因此，每種菌株對(duì)環(huán)境溫度的要求有一個(gè)最適宜的生長(zhǎng)范圍，本研究菌株最適宜的培養(yǎng)溫度在27.5-32℃之間。pH通過(guò)以下3個(gè)方面對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響：一是使蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)所帶電荷發(fā)生改變，從而影響其生命活性；二是引起細(xì)胞膜電荷變化，導(dǎo)致微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力改變；三是改變環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)及有害物質(zhì)的毒性。同時(shí)pH是反應(yīng)菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，不同的菌株對(duì)pH條件的要求各不相同，它們只能在一定的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，然而每個(gè)菌株的生長(zhǎng)最適宜的pH常限制于一個(gè)較小的范圍。該菌株在pH 7-9范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，說(shuō)明該菌株具有一定的耐堿性。微生物的生長(zhǎng)繁殖需要適宜的營(yíng)養(yǎng)，碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、生長(zhǎng)因子等都是微生物生長(zhǎng)所必須，缺少其中一種，微生物便不能正常生長(zhǎng)、繁殖。同時(shí)營(yíng)養(yǎng)元素的比例也會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，該菌株最適的C∶N為10∶1，在該營(yíng)養(yǎng)元素比例下，可以為微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境。高鹽度對(duì)微生物的毒害作用主要是通過(guò)升高環(huán)境滲透壓而破壞微生物的細(xì)胞膜和菌體內(nèi)的酶，從而破壞微生物的生理活動(dòng)。微生物生長(zhǎng)繁殖受到鹽度影響的作用主要有3種情況：脫水死亡、物質(zhì)吸收過(guò)程受干擾阻斷死亡和中毒死亡。不同微生物對(duì)滲透壓的適應(yīng)能力不同。該菌株屬于耐鹽度比較高的菌株，西南地區(qū)頁(yè)巖氣井場(chǎng)附近的土壤含鹽量較低，均未超過(guò)1%［8］，由此可見該菌株適用于頁(yè)巖氣井場(chǎng)附近石油和重金屬?gòu)?fù)合污染區(qū)的修復(fù)。

3.3 Ni2+和石油濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的特性的影響

菌株的適應(yīng)期相對(duì)有所延長(zhǎng)，可能由于金屬離子的存在對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生了毒害作用。由于隨著Ni2+濃度的升高，使得對(duì)數(shù)期縮短或者存在不明顯，從而使細(xì)胞總量減少。但是從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看，Ni2+濃度在200 mg/L以下時(shí)，菌株受到的抑制比較小，最大OD值達(dá)到了2.1左右，和生長(zhǎng)曲線相比，反而能得出低濃度的金屬離子的存在反而會(huì)促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)［34］；當(dāng)Ni2+濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，才出現(xiàn)明顯的抑制，說(shuō)明該菌株對(duì)鎳的抗性比較強(qiáng)。重金屬等離子的抑菌作用主要是使菌體蛋白質(zhì)變性，或者是與酶的-SH結(jié)合使酶失去活性。不同因素對(duì)微生物的影響不同，同一因素因其濃度不同，對(duì)微生物的影響也不同。

原油的質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)對(duì)原油降解菌產(chǎn)生毒害作用，抑制菌體的正常生長(zhǎng)繁殖，最終將會(huì)導(dǎo)致原油降解率下降，從而影響石油污染物的去除。另外，原油質(zhì)量濃度過(guò)高，在培養(yǎng)基表面會(huì)形成一層油膜，油膜會(huì)阻止空氣中的氧氣向水體內(nèi)部擴(kuò)散，導(dǎo)致水中的溶解氧不足，從而抑制好氧微生物的生長(zhǎng)［35］，因此也會(huì)出現(xiàn)原油質(zhì)量濃度的升高，微生物對(duì)生命力下降的現(xiàn)象。綜上所述，該菌株對(duì)原油濃度有較高的耐受性。

由于篩選出來(lái)的該菌株將用于實(shí)際復(fù)合污染土壤的修復(fù)，該污染土壤中石油類污染物濃度較低，均未超過(guò)1%［8］，因此固定原油的濃度，調(diào)節(jié)鎳離子的濃度考察混合濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合污染物的對(duì)菌株的生長(zhǎng)有較大程度的抑制，說(shuō)明該菌株對(duì)復(fù)合污染物的抗性減弱。

4 結(jié)論

從四川省長(zhǎng)寧-威遠(yuǎn)頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)重度污染土壤中，分離得到一株耐重金屬鎳的石油降解菌株，經(jīng)過(guò)對(duì)菌株與菌落的觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA分析，鑒定該菌株為法氏檸檬酸桿菌，命名為Citrobacter farmeri strain M1。該菌在重金屬鎳和石油污染的生物修復(fù)過(guò)程中起重要作用。（2）檸檬酸桿菌M1的生長(zhǎng)條件試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株具有較寬泛的pH生長(zhǎng)范圍，在pH7-9范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好；在鹽濃度1%-5%范圍內(nèi)能較好地生長(zhǎng)，并具有一定的耐堿性。當(dāng)鹽濃度超過(guò)5%該菌株生長(zhǎng)受到抑制，屬于耐鹽度較高的菌株。檸檬酸桿菌M1生長(zhǎng)的最佳條件為是溫度為30℃，pH為9，C∶N為10∶1，鹽最高耐受度為5%。（3）在液體培養(yǎng)基中，檸檬酸桿菌M1對(duì)石油和重金屬鎳有較好的降解和去除作用，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)該菌株對(duì)原油降解率可達(dá)到35.65%，對(duì)重金屬Ni2+的去除率和吸附率分別達(dá)到56.64%和54.16%，同時(shí)對(duì)金屬鎳的抗性可達(dá)到300mg/L。

［1］ 吳孟余. 我國(guó)頁(yè)巖氣開發(fā)現(xiàn)狀與展望［J］. 電力與能源, 2014,35（4）：405-407.

［2］ 胡穎, 彭博. 美國(guó)頁(yè)巖氣開發(fā)現(xiàn)狀及其能源發(fā)展趨勢(shì)［J］. 廣東化工, 2014, 41（23）：82-83.

［3］ 杜群, 萬(wàn)麗麗. 美國(guó)頁(yè)巖氣能源開發(fā)的環(huán)境法律管制及對(duì)中國(guó)的啟示［J］. 中國(guó)政法大學(xué)學(xué)報(bào), 2015（6）：146-158.

［4］ 郭亦成. 四川省頁(yè)巖氣開發(fā)研究［D］. 成都：四川省社會(huì)科學(xué)院, 2016.

［5］ 于慧龍. 論頁(yè)巖氣開發(fā)利用的革命性影響和作用［D］. 重慶：重慶師范大學(xué), 2013.

［6］ 王景藝. 非傳統(tǒng)能源開發(fā)對(duì)氣藏區(qū)周邊水系統(tǒng)的影響分析［D］.北京：華北電力大學(xué), 2016.

［7］ 孟永濤. 頁(yè)巖氣水平井油基泥漿體系的研究及應(yīng)用［D］. 荊州：長(zhǎng)江大學(xué), 2013.

［8］ 朱天菊, 解藝平, 吳波, 等. 頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)污染土壤可生化性研究［J］. 廣州化工, 2017（3）：60-62.

［9］ 盧邦俊. 頁(yè)巖氣鉆屑中的重金屬成分究［J］. 能源環(huán)境保護(hù),2015, 29（5）：33-34.

［10］ 駱永明. 污染土壤修復(fù)技術(shù)研究現(xiàn)狀與趨勢(shì)［J］. 化學(xué)進(jìn)展,2009, 21（203）：558-565.

［11］ Lu M. The use of goosegrass（Eleusine indica）to remediate soil contaminated with petroleum［J］. Water, Air, & Soil Pollution,2010, 209（1）：181-189.

［12］ Xu Y, Lu M. Bioremediation of crude oil-contaminated soil：comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments［J］. Journal of Hazardous Materials, 2010, 183（1-3）：395-401.

［13］ Alisi C, Musella R, Tasso F, et al. Bioremediation of diesel oil in a co-contaminated soil by biougmentation with a microbial formula tailored with native strains selected for heavy metals resistance［J］. Science of the Total Environment, 2009, 407（8）：3024-3022.

［14］ Atagana HI. Bioremediation of co-contamination of crude oil and heavy metals in soil by phytore-mediation using chromolaena odorata, （L）King & H. E. Robinson［J］. Water, Air, & Soil Pollution, 2011, 215（1）：261-271.

［15］ PéREZ RM. Combined strategy for the precipitation of heavy metals and biodegradation of petroleum in industrial wastewaters［J］. Journal of Hazardous Materials, 2010, 182（1-3）：896-902.

［16］ Yang W, Zhang T, Li S, et al. Metal removal from and microbial property improvement of a multiple heavy-metals contaminated soil by phytoextraction with a cadmium hyperaccumulator Sedum alfredii, H［J］. Journal of Soils and Sediments, 2014, 14（8）：1385-1396.

［17］ 李亭亭. 石油-重金屬?gòu)?fù)合污染鹽漬土生物修復(fù)中MCB對(duì)重金屬的鈍化研究［D］. 濟(jì)南：山東師范大學(xué), 2014.

［18］ Reddy KR. Technical challenges to in-situ remediation of polluted Sites［J］. Geotechnical and Geological Engineering, 2010, 28（3）：211-221.

［19］ 杜連祥, 路福平. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2010.

［20］ 馬前, 曹同成. 新型耐金屬微生物的篩選研究［C］// 2013中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì),（第五卷）, 2013.

［21］ 王慧萍. 耐鋅細(xì)菌的篩選、抗鋅特性及其對(duì)苯酚的降解研究［D］. 上海：東華大學(xué), 2011.

［22］ 付瑾. 鎘抗性菌DX-T3-01的篩選鑒定與吸附鎘機(jī)理及其降解苯酚特性研究［D］. 上海：東華大學(xué), 2011.

［23］ 金忠民, 郝宇, 劉麗杰, 等. 一株鉛鎘抗性菌株的分離鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2015（7）：3551-3557.

［24］ 孫士順. 重金屬銅抗性細(xì)菌的篩選鑒定、吸附特性與機(jī)理研究［D］. 長(zhǎng)春：東北師范大學(xué), 2016.

［25］ 曹德菊, 王方, 胡海榮. 抗鉛微生物的篩選及對(duì)水中鉛的去除效果研究［J］. 環(huán)境與健康雜志, 2011, 28（1）：66- 68.

［26］ 張漢波, 鄭月, 曾凡, 等. 幾株細(xì)菌的重金屬抗性水平和吸附量［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2005, 32（3）：24-29.

［27］ 悉旦立. 環(huán)境監(jiān)測(cè)（修訂版）［M］. 北京：高等教育出版社,1995.

［28］ Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain specific 16Sprimers［J］. Journal of Microbiological Methods,2003, 55（3）：541-555.

［29］ 林辰壹, 馬娟, 楊婷婷, 等. 優(yōu)化氮源種類及碳氮比對(duì)阿魏菇液體種生長(zhǎng)的效應(yīng)［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 49（11）：2042-2047.

［30］ 趙本良, 仇榮亮, 劉金芩, 等. 一株硫酸鹽還原細(xì)菌的篩選及其功能研究［C］// 第十次全國(guó)環(huán)境微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集. 2007.

［31］ Chen C, Lei W, Min L, et al. Characterization of Cu（II）and Cd（II）resistance mechanisms in Sphingobium sp. PHE-SPH and Ochrobactrum sp. PHEOCH and their potential application in the bioremediation of heavy-Metal phenanthrene co-contaminated sites［J］. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23（7）：6861.

［32］ Dave S, Damani M, Tipre D. Copper remediation by Eichhornia spp. and sulphate-reducing bacteria［J］. Journal of Hazardous Materials, 2010, 173（13）：231-235.

［33］ Limcharoensuk T, Sooksawat N, Sumarnrote A, et al.Bioaccumulation and biosorption of Cd2+and Zn2+by bacteria isolated from a zinc mine in Thailand［J］. Ecotoxicol Environ Saf, 2015, 122：322-330.

［34］ 趙曉秀. 重金屬銅復(fù)合污染土壤中石油的微生物降解［D］.大連：大連理工大學(xué), 2008.

［35］ 謝鯤鵬, 周集體, 曲媛媛, 等. 一株耐鹽原油降解菌的分離鑒定及其降解特性研究［J］. 海洋環(huán)境科學(xué), 2009, 28（6）：680-683.

Isolation and Identification of a Nickel-resistant and Petroleum Hydrocarbon Degrading Strain and Its Biological Characteristics

MA Yong-song LI Xi LI Zhen-zhen WANG Pei-jie
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest Petroleum University，Chengdu 610500）

A bacterial strain with high ability of nickel resistance and petroleum-degrading was isolated from the soil of heavily-polluted areas around the shale gas wells in Changning-Weiyuan，Sichuan Province，and its biological characteristics and physiological-biochemical indexes were studied. The seed liquid was inoculated into the liquid medium containing heavy metal and crude oil，cultured at 30℃ and 130 r/min for 7 days to explore the resistance of the strain to nickel ions（Ni2+）and the rate of degrading total petroleum hydrocarbon（TPH）.Further，the strain was identified based on the experimental results of physiology and biochemistry，morphological observation and 16S rDNA sequences. As results，the tolerance of the strain to Ni2+reached 300 mg/L，and the removal rate and adsorption rate of Ni2+reached 56.64% and 52.16%，respectively; meanwhile，the degradation rate of TPH reached 35.65%. The species of the strain belonged to Citrobacter（Citrobacter sp.）and named Citrobacter farmeri strain M1. The optimal growth temperature of this strain was 30℃，the optimal growth pH was from 7 to 9，the optimal C∶N was 10∶1，and the maximum salt tolerance was up to 5%. In conclusion，solid nickel resistance and petroleum degradability of the strain contributes to its applicability in the remediation of heavy metal and oil-contaminated soil.

petroleum-degrading bacterium；nickel resistance；isolation and identification；biological characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0687

頁(yè)巖氣是一種清潔高效的能源，已經(jīng)成為繼石油、煤炭之后的一種重要能源［1-2］。美國(guó)“頁(yè)巖氣革命”的成功為我國(guó)帶來(lái)了新啟示，中國(guó)頁(yè)巖氣于2011年被批準(zhǔn)為獨(dú)立礦種，隨后國(guó)家出臺(tái)多種政策鼓勵(lì)頁(yè)巖氣開發(fā)［3］。在此背景下，四川省豐富的頁(yè)巖氣資源成為了能源開發(fā)的新熱點(diǎn)［4］。然而，頁(yè)巖氣的開發(fā)帶來(lái)的不僅僅是能源，同時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的壓力［5］。頁(yè)巖氣開采過(guò)程可能會(huì)造成土壤的污染，鉆井廢棄泥漿是油井開采過(guò)程中產(chǎn)生的污染物，包含礦物油、酚類化合物及重金屬等復(fù)雜多項(xiàng)體系［6-7］。西南地區(qū)部分頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)附近土壤和鉆屑中石油類污染物和重金屬（Ni）都超過(guò)環(huán)境的閾值［8-9］，其中長(zhǎng)寧-威遠(yuǎn)地區(qū)土壤中鎳的含量超過(guò)《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB15618-2008）三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)限值，達(dá)到210.19 mg/kg［8］。由此治理在頁(yè)巖氣開采過(guò)程中造成的石油類污染土壤的同時(shí)，對(duì)重金屬超標(biāo)的處理同樣不可忽視。而且持久性有機(jī)污染物和重金屬（Cd、Pb和Ni等）污染的現(xiàn)象比較突出［10］。其中石油類污染一直是環(huán)境的主要問題［11-12］，石油和重金屬在某些情況下可以共存，更難于修復(fù)［13-14］，重金屬和有機(jī)污染物造成的土壤污染已成為主要的全球環(huán)境和人體健康問題［15］，而如何修復(fù)多組分污染物土壤已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問題。利用微生物技術(shù)修復(fù)復(fù)合污染土壤起著重要作用，抗性微生物不僅可以以石油為唯一碳源對(duì)石油進(jìn)行降解，還可以吸附和氧化還原重金屬，將有毒害的金屬元素轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或者低毒的金屬離子，有利于重金屬在土壤中沉淀固定［16］。生物法修復(fù)多組分污染物目前仍處于起步階段，對(duì)于微生物修復(fù)技術(shù)在石油-重金屬?gòu)?fù)合污染土壤的修復(fù)研究尚且較少［17-18］，在頁(yè)巖氣開發(fā)井場(chǎng)復(fù)合污染土壤的修復(fù)研究更是空白，其作用機(jī)理及影響因素還需進(jìn)一步研究。

2017-08-21

四川省科技支撐計(jì)劃（2015-SZ-0007）

馬永松，男，碩士研究生，研究方向：土壤生態(tài)環(huán)境修復(fù)；E-mail：hjmays@163.com

李琋，女，副教授，研究方向：生態(tài)環(huán)境修復(fù)；E-mail：icy124@hotmail.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）