同源異型盒基因HOXA5對胃癌細胞BGC823侵襲能力的影響

周 博

同源異型盒基因HOXA5對胃癌細胞BGC823侵襲能力的影響

周 博

目的檢測人胃癌組織中HOXA5基因的表達情況，觀察干擾HOXA5基因的表達之后，胃癌細胞BGC823的遷移和侵襲能力的變化，為闡明HOXA5在胃癌向遠處轉移的分子機制中提供新的思路。方法通過實時定量PCR(qRT-PCR)、Western blot以及免疫組織化學等技術,檢測胃癌組織中HOXA5基因的表達。應用細胞轉染的方法將HOXA5基因的過表達質粒轉入胃癌細胞BGC823中，經qRT-PCR和Western blot驗證HOXA5表達上調之后，利用Transwell侵襲實驗檢測BGC823細胞侵襲能力的變化。結果在收集的69例新鮮的胃癌組織以及相對應的癌旁組織中，免疫組織化學顯示相比于癌旁組織的表達情況，胃癌組織中只有26例HOXA5的表達高于癌旁組織，比例為37.7%；qRT-PCR、Western blot檢測發(fā)現相對于癌旁組織，胃癌組織中HOXA5的表達水平顯著下調(mRNA水平下調3倍，蛋白水平下調2倍，差異具有統計學意義，P<0.05)。BGC823細胞轉染了過表達質粒之后，HOXA5的表達能夠被上調。過表達了HOXA5基因的BGC823細胞的侵襲能力下降。結論在胃癌組織中HOXA5的表達下調，而在胃癌細胞BGC823中增強HOXA5的表達能夠降低細胞的侵襲能力，說明HOXA5在胃癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲、轉移中發(fā)揮著抑癌基因的作用，可作為一個新的治療靶點。

HOXA5；胃癌；BGC823細胞；侵襲；轉移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1406～1410)

胃癌的發(fā)生率在全球最常見的腫瘤中排第四位，然而它確是癌癥死亡的第二大原因[1]，這其中主要的原因是因其易復發(fā)和易轉移的特點。我國陳萬青教授等[2]領銜的研究發(fā)現在2009年我國胃癌新發(fā)病例30949例，死亡病例22120例，發(fā)病率為36.21/10萬，死亡率為25.88/10萬，雖然與2008年相比并沒有大幅上升，但發(fā)病率和死亡率仍然很高。胃癌已經成為對公眾健康有重大影響的疾病。目前對胃癌的治療主要以手術切除為主，術后5年生存率約20%～30%[3]，許多胃癌患者發(fā)現時即已經到了晚期。闡明其發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉移的機制對于更好地預防和治療胃癌具有重要的意義。HOX 基因屬于同源異形盒基因家族的一員，在進化上高度保守[4]。相關研究結果證明，人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后也有HOX 基因的參與[5]。HOXA5為HOX 基因編碼的1個蛋白之一，它可以與DNA結合進而激活或者抑制下游靶基因的表達。一項最近的研究表明，在乳腺癌中HOXA5的表達是抑制的，提示它是1個腫瘤抑制子，抑制乳腺癌的侵襲轉移[6]。然而其他的研究者發(fā)現在食管鱗癌組織中它是高表達的[7]，說明它又可能是1個促進腫瘤細胞增殖的癌基因。HOXA5在不同的腫瘤中是促癌還是抑癌爭論性比較大，至于HOXA5在胃癌中表達如何，以及它在胃癌的生發(fā)發(fā)展、侵襲轉移的過程中扮演什么角色，至今研究的人很少。為了解決這一科學問題，我們需要觀察HOXA5如何影響胃癌細胞的侵襲、遷移能力，并闡明其表達情況，以便更科學的定義它在胃癌中的作用，為將來將其作為新的生物治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

BGC823細胞(人胃癌細胞株)購自中國科學院上海生命科學研究院。即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒購自南京蓋博生物技術有限公司。RIPA裂解液、蛋白抽提試劑盒Ⅰ購自北京普利萊基因技術有限公司。LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司(USA)。逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、質粒提取試劑盒等均購自寶大連生物工程有限公司(TaKaRa)。兔抗人HOXA5多克隆抗體購自美國ABcam公司，兔抗人GAPDH抗體購自美國Proteintech。山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物有限公司。TRIzol 試劑、化學發(fā)光檢測試劑盒等購自北京天根生物科技有限公司。HOXA5過表達質粒購買自蘇州吉瑪基因股份有限公司。HOXA5和GAPDH的實時RT-PCR引物等均由生工(上海)有限公司合成。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 組織

病理組織來源于2012年5月至2014年7月期間在我院住院并接受胃癌根治術的患者手術切除的新鮮胃癌組織標本，標本均經病理確診為胃癌，取距離癌組織5 cm的正常胃粘膜組織作為癌旁標本，本研究中共收集了69例，患者平均年齡(53.2±11.2)歲,所有患者手術之前均接受放化療與抗腫瘤藥物治療。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測組織蛋白表達 新鮮組織標本用福爾馬林浸泡、固定，然后用石蠟包埋，切片后烘烤2 h。脫蠟后用pH 7.4的PBS沖洗3次，每次3 min。取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，中檔微波處理10 min，取出微波盒流水自然泠卻，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗3次，每次3 min。每張切片加1滴3% H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。去除PBS，然后再在每張切片上加1滴相HOXA5一抗抗體，室溫孵育2 h；PBS沖洗3次，每次5 min。去除PBS，每張切片加1滴聚合物增強劑，室溫孵育20 min；PBS沖洗3次，每次3 min。去除PBS，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS液，每張切片加1滴DAB液，靜置5 min。蘇木精復染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，晾干后顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 qRT-PCR檢測HOXA5 mRNA 表達情況 將胃癌組織或癌旁組織研磨碎，或收集各組經處理的BGC823細胞，應用TRIzol試劑法提取各組細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒其反轉錄成cDNA反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，隨后以此cDNA為模板進行qRT-PCR。qRT-PCR引物序列見表1 。PCR反應條件：95 ℃ 30 s ；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt 值表示各基因 mRNA 的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 Western blot檢測HOXA5的蛋白表達情況 將胃癌組織或癌旁組織研磨碎，或收集各組經處理的BGC823細胞，提取細胞總蛋白。用10%SDS-PAGE膠將提取的蛋白質分離，然后將其轉移至PVDF膜上，封閉1 h ；將相應的PVDF膜浸入含1∶1000的抗HOXA5和GAPDH抗體的一抗稀釋液中4 ℃孵育；第二天將膜取出用TBST液漂洗3次，每次10 min，按1∶10 000稀釋濃度加入羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；用TBST 液漂洗3 次，每次10 min；加入化學發(fā)光試劑顯影成像，Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的表達情況以HOXA5與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.3.4 HOXA5質粒大提 HOXA5過表達質粒購買自蘇州吉瑪基因股份有限公司。取適量均勻小搖，然后大搖。按照質粒提取試劑盒的說明書步驟提取質粒，備用。

1.3.5 細胞培養(yǎng)及轉染 人胃癌細胞株BGC823置于37 ℃、CO2體積分數為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含100 U/ml雙抗的DMEM(Gibco,USA) 培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。轉染前24 h接種細胞于6 cm培養(yǎng)皿中，當細胞融合度約70%時換無雙抗的DMEN培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)4 h，然后用LipofectaminTM2000按照說明書將質粒轉染入細胞中，轉染分兩組：HA-HOXA5組和HA-Vector組。于轉染6 h后更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取一半細胞提取RNA，48 h后提取剩余的總蛋白。

1.3.6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 使用Transwell檢測BGC823細胞的侵襲能力變化。取對數期的BGC823細胞，經過胰酶消化后，大約按2×105細胞數加入到每個小室，用不含血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，放置在含有10%的血清培養(yǎng)液的24孔板上，放置在5%CO2環(huán)境內孵育24 h，甲醛固定20 min，用PBS洗3遍。顯微鏡(×200)下計數遷移至濾膜外表面的細胞數，實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件，數據以均數±標準差表示，方差分析用于多組間數據的比較，t檢驗用于兩組間數據的比較；而Tukey 法或Dunnett’s T3 法用于組間兩兩比較分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測胃癌組織中HOXA5基因表達情況

應用免疫組織化法，在收集的69例胃癌以及對應的癌旁組織中對HOXA5的表達進行定性分析，發(fā)現只有26例患者的癌組織中HOXA5表達接近或者高于癌旁組織，染色強于癌旁組織者26例(37.7%)，染色弱于癌旁組織者43例(62.3%)。

2.2 胃癌以及癌旁組織中HOXA5mRNA 和蛋白表達情況

應用qRT-PCR檢測HOXA5mRNA的表達情況，與GAPDH對比進行定量分析。

結果發(fā)現：與癌旁組織相比，HOXA5在胃癌組織中表達降低，與GAPDH進行定量對比分析胃癌組織為(0.149±0.067)，癌旁組織為(0.328±0.085)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

Western blot檢測HOXA5的蛋白表達情況，結果如圖1所示：胃癌組織中HOXA5表達明顯低于癌旁組織，與GAPDH對比進行定量分析，結果為胃癌組織(0.342±0.024)，癌旁組織(0.975±0.105)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 胃癌和癌旁組織中HOXA5和GAPDH的Western blot成像圖

2.3 HOXA5過表達質粒效果驗證

應用qRT-PCR檢測BGC823細胞中HOXA5mRNA的表達情況；48 h后提取細胞總蛋白，用Western blot檢測BGC823細胞中HOXA5的蛋白表達情況發(fā)現，相比于轉染了HA-Vector質粒組(0.5123±0.087)，轉染了HA-HOXA5質粒組的BGC823細胞HOXA5基因表達(1.639±0.088)明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.05)，結果見圖2。

A為qRT-PCR量化柱狀圖，B為Western blot成像圖。

2.4 上調HOXA5的表達導致BGC823細胞的侵襲能力下降

BGC823細胞分別轉染HA-Vector和 HA-HOXA5質粒，48 h后經胰酶消化，細胞按2×105細胞數加入到每個Transwell小室，繼續(xù)用培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，36 h后經染色在顯微鏡(×200)下計數遷移至濾膜外的細胞，結果見圖3。與HA-Vector組比較，HA-HOXA5組的BGC823細胞侵襲、遷移能力下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。

A為Transwell侵襲實驗；B為遷移至Transwell小室濾膜外的細胞數計數圖。

3 討論

同源異形盒基因是1類串聯成簇地排列在不同染色體上的基因，即HOX基因。人類有39個HOX基因，分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 4簇，其中HOXA位于chr17p14-15[4]。HOX 基因編碼的蛋白可以與DNA結合進而激活或者抑制下游靶基因的表達[8],研究表明HOX基因可以控制細胞屬性，比如細胞分化、細胞親和力等[9]，除此之外，HOX基因在腫瘤中的作用也越來越得到研究者的重視[10-13]。研究發(fā)現，HOX基因在腫瘤中的作用不是固定的，在不同的階段和不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的功能，以HOXB9為例，其表達越低的組織，淋巴結轉移越早，患者生存期越短[14]，而在結腸癌組織中確實高表達的[15],但是在晚期或者分化程度越低的結腸癌中表達越低，預后也越差。因此，研究HOX基因在不同的腫瘤中的表達以及其對腫瘤細胞生物學特征的影響，對充分了解HOX基因具有深遠意義。有研究者發(fā)現HOXA5基因在非小細胞肺癌中低表達并能抑制腫瘤的侵襲轉移[16];然而，在急性髓細胞性白血病(AML)中，HOXA5的高表達可導致AML的治療效果更差，提示它與AML腫瘤細胞的耐藥性有關[17]。HOXA5在胃癌中的作用，有研究[18]發(fā)現，上調miR-196a可使胃癌細胞的侵襲和遷移能力增加，而這一作用是通過miR-196a的靶基因HOXA5實現的，說明HOXA5在胃癌中可能發(fā)揮著抑癌的作用。為了進一步闡明HOXA5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本文對HOXA5進行更進一步的研究。我們的研究發(fā)現，在胃癌組織中，HOXA5的表達的降低的(相對于癌旁組織)；而在胃癌細胞BGC823中回復HOXA5的表達能抑制細胞的侵襲能力。綜上所述，我們的研究首次報道了在胃癌組織中HOXA5的表達時降低的，并能夠控制胃癌細胞的侵襲轉移。HOXA5可作為診斷和治療胃癌的一個新的生物標記和靶基因。

[1] Long ZW,Yu HM,Wang YN,et al.Association of IL-17 polymorphisms with gastric cancer risk in Asian populations〔J〕.World J Gastroenterol,2015,21(18):5707-5718.

[2] 鄭朝旭,鄭榮壽,陳萬青.中國2009年胃癌發(fā)病與死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2013,22(5):327-332.

[3] Qinghai Z,Yanying W,Yunfang C,et al.Effect of interleukin-17A and interleukin-17F gene polymorphisms on the risk of gastric cancer in a Chinese population〔J〕.Gene,2014,537(2):328-332.

[4] 牛苗苗,戰(zhàn) 軍,張宏權.HOX基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用〔J〕.解剖學報,2014,45(3):430-436.

[5] Grier DG,Thompson A，Kwasniewska A,et al.The pathophysiology of HOX genes and their role in cancer〔J〕.J Pathol，2005,205(2):154-171.

[6] Raman V,Martensen SA,Reisman D,et al.Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumors〔J〕.Nature,2000,405(6789):974-978.

[7] Takahashi O，Hamada J，Abe M，et al.Dysregulated expression of HOX and ParaHOX genes in human esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Oncol Rep，2007,17(4):753-760.

[8] Bhattacharjee A,Ghangal R,Garg R,et al.Genome-wide analysis of homeobox gene family in legumes:identification,gene duplication and expression profiling〔J〕.PLoS ONE,2015,10(3):e0119198.

[9] Sánchez-Herrero E.Hox targets and cellular functions〔J〕.Scientifica,2013,2013:738257.

[10] Darda L,Hakami F,Morgan R,et al.The role of HOXB9 and miR-196a in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS ONE，2015,10(4):e0122285.

[11] Duan R,Han L,Wang Q,et al.HOXA13 is a potential GBM diagnostic marker and promotes glioma invasion by activating the Wnt and TGF-β pathways〔J〕.Oncotarget，2015,6(29):27778-27793.

[12] Lv X,Li L,Lv L,et al.HOXD9 promotes epithelial-mesenchymal transition and cancer metastasis by ZEB1 regulation in hepatocellular carcinoma〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2015,34:133.

[13] Hussain I,Bhan A,Ansari KI,et al.Bisphenol-A induces expression of HOXC6,an estrogen-regulated homeobox-containing gene associated with breast cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta,2015,1849(6):697-708.

[14] Sha S，Gu Y,Xu B，et al.Decreased expression of HOXB9 is related to poor overall survival in patients with gastric carcinoma〔J〕.Dig Liver Dis，2013，45(5):422-429.

[15] Huang K,Yuan R,Wang K,et al.Overexpression of HOX-B9 promotes metastasis and indicates poor prognosis in colon cancer〔J〕.Chin J Cancer Res，2014,26(1):72-80.

[16] Wang CC,Su KY,Chen HY,et al.HOXA5 inhibits metastasis via regulating cytoskeletal remodelling and associates with prolonged survival in non-small-cell lung carcinoma〔J〕.PLoS ONE,2015,10(4):e0124191.

[17] 李麗麗,夏瑞祥.同源異型盒基因5在急性髓細胞性白血病中表達的研究〔J〕.安徽醫(yī)學,2015,36(12):1459-1462.

[18] 尹凌帝,孫 倩,林夢潔,等.miR-196a調控HOXA5對人胃癌細胞MGC-803侵襲轉移的影響及機制研究〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2014,19(3):193-198.

(編輯：吳小紅)

EffectofHOXA5ontheInvasionAbilityofHumanGastricCancerCellLineBGC823

ZHOUBo.

TheFirstAffiliatedHospitalofHe'nanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003

ObjectiveTo detect the expression of HOXA5 in human gastric carcinoma;and observe the changes of gastric cancer cell BGC823’s migration and invasion ability after interference the expression of HOXA5 gene,and provide a new idea to clarify the molecular mechanism role of HOXA5 in the metastasis of gastric cancer.MethodsReal-time quantitative PCR(qRT-PCR),Western blot and immunohistochemistry were performed to detect the expression of HOXA5 gene in gastric cancer tissues.The overexpression plasmid of HOXA5 was transferred into gastric cancer cell BGC823 by the method of cell transfection,we use qRT-PCR and western blot to confirm the overexpression effect,and then the changes of invasion ability of BGC823 cells were detected by transwell invasion assay.ResultsIn the 69 cases of fresh gastric cancer tissue and the corresponding adjacent non-tumourous tissue,immunohistochemistry showed that in all gastric carcinoma tissue only 26 cases present HOXA5’s expression was higher than that in adjacent non-tumourous tissue,the proportion was 37.7%.Detection of qRT-PCR and western blot showed that the expression of HOXA5 was significantly lower in gastric cancer tissues than in adjacent non-tumourous tissue(the level of mRNA was down 3 times,and the protein was 2 times，the difference was statistically significant,P<0.05).In BGC823 cells,which have transfected overexpression plasmid of HOXA5,the expression of HOXA5 was up-regulated,and the invasion ability of BGC823 cells was decreased.ConclusionThe expression of HOXA5 in gastric carcinoma decreased.Enhance the expression of HOXA5 in gastric cancer cell line BGC823 can reduce the invasion ability of cells.HOXA5 is a tumor suppressor in the development,invasion and metastasis of gastric cancer.It can be a new therapeutic target.

HOXA5;Gastric carcinoma;BGC823 cell;Invasion;Metastasis

471003 河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.004

R735.2

A

1001-5930(2017)09-1406-05

2016-10-24

2017-06-12)