張曉曉，張堯，馮偉，程林峰，王芳，應(yīng)旗康，馬瑞雪，馬鐵軍，劉梓諭，劉蓉蓉，張亮，葉偉，張芳琳，徐志凱，吳興安

第四軍醫(yī)大學(xué) a.微生物學(xué)教研室；b.學(xué)員旅；陜西 西安 710032

qRT-PCR快速檢測(cè)漢灘病毒抗體中和活性實(shí)驗(yàn)方法的建立

張曉曉a，張堯b，馮偉b，程林峰a，王芳a，應(yīng)旗康a，馬瑞雪a，馬鐵軍a，劉梓諭a，劉蓉蓉a，張亮a，葉偉a，張芳琳a，徐志凱a，吳興安a

第四軍醫(yī)大學(xué) a.微生物學(xué)教研室；b.學(xué)員旅；陜西 西安 710032

目的：建立一種基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法，快速、定量檢測(cè)漢灘病毒感染中的中和抗體活性。方法：將本室前期制備的抗?jié)h灘病毒高中和活性鼠源性單抗3G1、鼠/人嵌合單抗1D9和感染劑量為100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1h后感染Vero-E6細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中漢灘病毒76-118株S基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上以細(xì)胞總RNA為檢測(cè)樣品，建立qRT-PCR快速、定量檢測(cè)漢灘病毒感染中中和抗體活性的實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果和結(jié)論：建立了一種基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法，可定量測(cè)定漢灘病毒感染中的中和抗體活性，該法具有快速、靈敏、特異和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

漢灘病毒；qRT-PCR；中和抗體；微量中和實(shí)驗(yàn)；腎綜合征出血熱

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），漢坦病毒屬（Hantavirus），是一種分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M分為L(zhǎng)、M、S三個(gè)片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein，GP，包括Gn和Gc）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）[1]。在臨床上主要引起以發(fā)熱、出血、急性腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)的腎綜合征出血熱（hemorrhag?ic fever with renal syndrome，HFRS）[2]。我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家，該病具有流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率高等特點(diǎn)。由于HFRS的宿主廣泛，傳播途徑多，迄今臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物，因此其防治任務(wù)十分艱巨。而特異性疫苗是目前預(yù)防HFRS的最主要措施之一[3]，因此準(zhǔn)確、高效地測(cè)定其中和抗體效價(jià)成為評(píng)價(jià)疫苗有效性以及檢測(cè)人群對(duì)HTNV感染后免疫力的關(guān)鍵。目前常用于檢測(cè)病毒中和抗體的方法主要是微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)，是病毒中和抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。然而，由于宿主細(xì)胞感染HTNV后一般不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic ef?fect，CPE），結(jié)果判定比較困難；且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般為9～13d，這些都極大地限制了利用傳統(tǒng)的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HTNV中和抗體的作用。因此，研究一種方便、快捷、高通量的測(cè)定中和抗體中和作用的方法顯得十分必要。

我們根據(jù)HTNV 76-118株S基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立了一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定HTNV中和抗體中和作用的實(shí)驗(yàn)方法，從而為HFRS新型疫苗的研究和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細(xì)胞Vero-E6購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；無血清培養(yǎng)基DMEM購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于上海生工生物工程公司；One-Step PrimeScript RT-PCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

HTNV 76-118株為本實(shí)驗(yàn)室保存；1A8為抗HTNV NP特異性高親和力鼠源性單抗；3G1為抗HTNV高中和活性鼠源性單抗；1D9是本室以3G1為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的抗HTNV鼠/人嵌合單抗，也具有高中和活性，均為本室制備保存。

細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Thomson公司；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司；IX71倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Stratagenen公司。

1.2 HTNV感染的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)

將Vero-E6細(xì)胞接種于1塊96孔板，于37℃孵箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞培養(yǎng)至單層后備用。用DMEM培養(yǎng)基將HTNV（TCID50=10-5.89）稀釋至100倍 TCID50，并分別稀釋單抗 3G1、1D9 至 10μg/mL，將稀釋后的病毒液分別與DMEM、單抗3G1、單抗1D9等體積混合后于37℃孵育1h，將孵育后的混合液替換E6單層細(xì)胞的培養(yǎng)液，96孔板每孔加入100μL混合液，每組8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔。37℃孵育90min后更換正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。96孔板每隔3d換液一次。第10d將96孔板于37℃和-80℃交替凍融3次，取裂解上清，用包被有抗HTNV NP的單抗1A8的酶標(biāo)板夾心ELISA檢測(cè)。

1.3 基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法

將Vero-E6細(xì)胞接種于2塊24孔板，微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)方法同1.2。24孔板每孔加入500μL混合液，每組10個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔。37℃孵育90min后更換正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h提取病毒感染組、單抗3G1混合組、單抗1D9混合組、正常細(xì)胞組各1孔細(xì)胞總RNA，共提取10d，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)HTNV 76-118株（GenBank登錄號(hào)為M14626.1）的S基因序列，利用Oligo6.0軟件及NCBI Blast分析設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。上游引物為HTNV-F（5'-GAGCCTGGAGACCATCTG-3'），下游引物為HTNV-R（5'-CGGGACGACAAAGGATGT-3'），引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3.2 驗(yàn)證PCR引物的有效性 以HTNV cDNA為模板，用HTNV-F/R特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定引物的有效性。

1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的建立 將從24孔板收取的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，反 應(yīng) 體 系 為 25μL[SYBR Premix ExTaq（2×）12.5μL，HTNV-F（10μmol/L）和 HTNV-R（10μmol/L）各1μL，模板2μL，用ddH2O補(bǔ)足]。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10s，95℃變性 5s，60℃退火/延伸20s，每個(gè)循環(huán)退火延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。在PCR過程中由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃，然后降至72℃，開始以0.2℃/s遞增加熱至95℃，檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立1個(gè)空白對(duì)照即不加模板，當(dāng)空白對(duì)照為陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)有效。Ct值≤30為陽性，Ct值＞30為陰性。

2 結(jié)果

2.1 微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)10d后，將微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)的96孔板于37℃和-80℃反復(fù)凍融3次，取裂解上清作為待檢樣品，用單抗1A8作為包被抗體，ELISA檢測(cè)抗體的中和活性。結(jié)果顯示HTNV 76-118分別和單抗3G1、單抗D9孵育后感染細(xì)胞，細(xì)胞中殘留的HTNV 76-118明顯減少，表明上述特異性單克隆抗體均能有效抑制HTNV在細(xì)胞中的感染和復(fù)制（圖1）。

2.2 基于qRT-PCR的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)改良法

2.2.1 引物有效性驗(yàn)證 以HTNV的cDNA為樣品，PCR擴(kuò)增HTNV S基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見在1300bp左右有一條明亮條帶，大小與預(yù)期相符（圖2）。

2.2.2 改良法qRT-PCR結(jié)果 將每隔24h從24孔板中提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)病毒基因。結(jié)果顯示感染24h后，中和抗體組（單抗3G1、單抗1D9）與HTNV 76-118孵育組病毒量明顯低于病毒感染組，與經(jīng)典的細(xì)胞微量中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。感染4d后病毒感染組的病毒量顯著增長(zhǎng)，而中和抗體組病毒增量不大，因此，可以選擇感染后第4d作為最佳檢測(cè)時(shí)間，與傳統(tǒng)的微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法相比大大縮短了檢測(cè)周期。見圖3。

3 討論

目前研究中的HTNV新型疫苗種類較多，疫苗接種后產(chǎn)生中和抗體的能力是評(píng)價(jià)其保護(hù)效應(yīng)的重要指標(biāo)[5]，而且流行病學(xué)調(diào)查也須檢測(cè)人群中中和抗體水平。國(guó)內(nèi)外已建立了多種中和抗體活性檢測(cè)方法，如過氧化物酶抗過氧化物酶（peroxidase-anti-peroxidase，PAP）法[6-7]、病毒空斑減少中和實(shí)驗(yàn)（plaque reduction neutralizaion test，PRNT）[8]、微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)等。上述方法前期病毒感染過程基本相同，而后期檢測(cè)各有特色。PAP法在感染3～5d后即可用冷甲醇或丙酮固定細(xì)胞，通透后依序加入對(duì)應(yīng)的抗體，用DAB顯色后通過染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。該法所需時(shí)間較短，且有一定的定量作用，但操作繁瑣，主觀性強(qiáng)。PRNT法是一種敏感度較高，可定量的抗體中和活性檢測(cè)方法，它是將病毒與抗體的混合液加入預(yù)先培養(yǎng)的受體細(xì)胞中，用空斑計(jì)數(shù)測(cè)定其中和滴度。該方法耗時(shí)長(zhǎng)，通量低，主觀性強(qiáng)，而且在測(cè)定過程中對(duì)HTNV的活性和敏感性要求較高。由于HTNV增殖周期長(zhǎng)，且缺乏明顯的CPE，微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)在最常用的中和活性檢測(cè)方法之一。此方法通常在病毒感染細(xì)胞9d后用雙抗體夾心ELISA法或熒光細(xì)胞中和法進(jìn)行檢測(cè)，同樣有耗時(shí)長(zhǎng)、通量低等缺陷。因此，急需發(fā)展快速有效的方法來進(jìn)行HFRS流行病學(xué)調(diào)查和評(píng)價(jià)HFRS新型疫苗保護(hù)效應(yīng)。

圖1 微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 qRT-PCR檢測(cè)微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

近幾年，利用qRT-PCR檢測(cè)中和抗體中和作用在病毒疫苗滴度檢測(cè)方面得到廣泛推廣，如麻疹病毒疫苗、輪狀病毒疫苗及痘病毒疫苗等[9-10]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法分為染料法和探針法，這2種方法都已被證實(shí)比常規(guī)RT-PCR更快速、靈敏[11]。SYBR GreenⅠ是一種雙鏈DNA結(jié)合染料，可以與任何雙鏈DNA結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低、敏感度高。探針法則是通過探針偶聯(lián)不同熒光基團(tuán)而同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè)，但相對(duì)成本較高。本研究中，我們對(duì)漢灘病毒的全基因組序列進(jìn)行了分析，針對(duì)其保守的S基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立了一種SYBR GreenⅠRealtime PCR方法，可快速測(cè)定漢灘病毒感染中中和抗體活性，在感染24h后病毒量甚微時(shí)即可定量檢測(cè)到病毒核酸。結(jié)果顯示病毒感染組的病毒載量（8.047×10-3）高于單抗 3G1（1.96×10-3）和 1D9組（3.01×10-3），之后48和72h的后續(xù)檢測(cè)結(jié)果皆延續(xù)了此趨勢(shì)。感染4d后病毒組的病毒量有顯著增長(zhǎng)，而中和抗體組病毒量增量不大。對(duì)感染第5～7d的樣本進(jìn)行持續(xù)檢測(cè)，病毒感染組病毒增長(zhǎng)速度變緩，與第4d的檢測(cè)結(jié)果相似。但第8d后病毒感染組的病毒載量呈下降趨勢(shì)，其原因可能是細(xì)胞在24孔板內(nèi)生長(zhǎng)8d后密度過高，細(xì)胞狀態(tài)下降導(dǎo)致通過細(xì)胞提取的核酸質(zhì)量不高，影響了檢測(cè)結(jié)果。因此，可選擇感染后第4d作為最佳檢測(cè)時(shí)間。與傳統(tǒng)方法相比，本實(shí)驗(yàn)通過熒光標(biāo)記放大了病毒感染信號(hào)，從而大大提高了檢測(cè)靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)，在結(jié)果判讀方面減少了人為誤差，更加確實(shí)可信。

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Establishment of a qRT-PCR Method for Quick Detection of Neutralizing Antibody Activity of Hantaan Virus

ZHANG Xiao-Xiaoa,ZHNAG Yaob,FENG Weib,CHENG Lin-Fenga,WANG Fanga,YING Qi-Kanga,MA Rui-Xuea,MA Tie-Juna,LIU Zi-Yua,LIU Rong-Ronga,ZHANG Lianga,YE Weia,ZHANG Fang-Lina,XU Zhi-Kaia,WU Xing-Ana*
a.Department of Microbiology;b.Student Brigade;Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
*Corresponding author,E-mail:wuxingan@fmmu.edu.cn

Objective:To develop a fast and accurate evaluation system for neutralization antibodies against Han?taan virus.Methods:Vero-E6 cells were incubated at 37℃for 1 hour in the presence of Hantaan virus at 100 TCID50infectious dose and candidate antibody（mAb 3G1 or murine/human chimeric mAb 1D9）.The total cellular RNAs from the incubation mix were extracted.The specific primers were designed according to the S gene se?quence of Hantavirus 76-118 in the GenBank database.The extracted total RNAs as template,qRT-PCR was per?formed to detect the effect of neutralization antibodies for Hantaan virus.Results& Conclusion:The method called qRT-PCR-based micro-cell-neutralization test was successfully established,which is capable to quantify the neutralizing antibodies rapidly and acurrately.

Hantaan virus;qRT-PCR;neutralization antibody;micro-neutralization test;hemorrhagic fever with renal syndrome

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0524-04

2017-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470890，31270978）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2013KTCL03-06）；軍隊(duì)重點(diǎn)課題（BWS13G024）

張曉曉（1985-），女，微生物學(xué)碩士，（E-mail）281166325@qq.com

吳興安，（E-mail）wuxingan@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.024