岳海梅，莊 華，鞏文峰，張新軍

(1.西藏農(nóng)牧學院植物科學學院，西藏林芝 860000； 2.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 3.西藏高原生態(tài)研究所，西藏林芝 860000)

青稞全蝕病和根腐病生防毛殼菌的篩選及鑒定

岳海梅1，2，莊 華2，鞏文峰1，張新軍3

(1.西藏農(nóng)牧學院植物科學學院，西藏林芝 860000； 2.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 3.西藏高原生態(tài)研究所，西藏林芝 860000)

青稞根腐病與青稞全蝕病是西藏青稞的常見根部病害，為篩選適合于防治青稞全蝕病與根腐病的毛殼菌，通過皿內(nèi)拮抗試驗、發(fā)酵粗提物抑菌試驗和溫室盆栽防效試驗對4株毛殼菌的抑菌活性進行了鑒定，通過形態(tài)學和分子生物學方法對高活性菌株進行了鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，在皿內(nèi)拮抗試驗中，毛殼菌41-4在培養(yǎng)第7天至第9天時，對青稞根腐病和全蝕病的抑制率分別達到60.00%和44.44%，抑菌帶寬度均達到1.4 cm。培養(yǎng)7 d時毛殼菌41-4發(fā)酵粗提物對青稞根腐病和全蝕病的抑制率分別達到64.44%和60.00%，抑菌帶寬度均達到1.5 cm。在溫室盆栽防效試驗中，毛殼菌41-4對青稞根腐病和全蝕病的發(fā)病嚴重度和病情指數(shù)均有降低作用，防效分別達到62.67%和39.45%。結合形態(tài)學特征和核糖體基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株41-4鑒定為球毛殼菌Chaetomiumglobosum。該生防菌株可用于開發(fā)微生物菌肥，對西藏的無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和保護西藏的原生態(tài)具有重要意義。

青稞全蝕?。磺囡?；毛殼菌；篩選；鑒定

青稞(Hordeumvulgarevar.nudumHooker f.)又稱裸大麥、元麥、米麥，主要分布在青藏高原的西藏和青海一帶，是西藏主要的糧食作物之一，占西藏糧食作物總播種面積的 61.50%[1]。近年來，隨著西藏經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的日益提高，農(nóng)民對種植糧食的生產(chǎn)積極性提高，但是隨之而來的農(nóng)作物病害成為影響西藏農(nóng)業(yè)持續(xù)、穩(wěn)定和健康發(fā)展的障礙，其中，青稞根腐病和全蝕病是主要的青稞根部病害。青稞根腐病是由真菌引起的世界性病害，該病害在加拿大、南亞、南非和中國的北方地區(qū)發(fā)生頻繁，嚴重時導致作物減產(chǎn)可達15%～30%，可導致青稞品質嚴重變劣[2-3]。青稞全蝕病在西藏青稞種植區(qū)也普遍發(fā)生，造成嚴重損失。

毛殼菌廣泛分布于自然界各種含纖維素的基質、土壤和有機肥中，能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶[4]，可有效降解纖維素、木質素等難降解大分子有機物，能夠拮抗土壤中的某些微生物，達到抑制病原菌生長和生物防治的作用[5-6]?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)有些毛殼菌，如球毛殼(Chaetomiumglobosum)和角毛殼(C.cupreum) 可以用來防治稻瘟病菌、蘋果黑斑病、小麥葉銹菌、種苗猝倒病和引起種子腐爛的多種病原菌[7-8]。利用毛殼菌制成的殺菌劑可以防止柑橘根、莖部的腐爛[9]。李 梅等[10]將外源的多菌靈抗性基因導入球毛殼菌，可提高球毛殼菌防治病害的能力。楊 謙等與泰國的Kasem博士合作，研制出了第一代毛殼菌生物防治制劑，在泰國已用于生產(chǎn)[11]。本研究擬通過對已分離的毛殼菌進行抗菌試驗，篩選出對西藏常見的青稞根腐病和青稞全蝕病具有防效的毛殼菌，為西藏青稞的無公害生產(chǎn)和西藏農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

青稞全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、青稞根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、毛殼菌41-4、毛殼菌39-6-2、毛殼菌LZT0016、毛殼菌Z24-12，均來自西藏農(nóng)牧學院植物病理學試驗室，青稞品種為藏青320。

1.2 皿內(nèi)拮抗試驗

將活化的毛殼菌、青稞全蝕病菌和青稞根腐病菌分別用直徑為7 mm的無菌打孔器打孔，用滅菌的鑷子分別取毛殼菌和病原菌接種在 PDA平板上，毛殼菌和病原菌相距4.5 cm，同時接種，以只接種病原菌的處理作為對照，重復3次。于28 ℃恒溫培養(yǎng)9 d，分別在培養(yǎng)的第3天、第5天、第7天和第9天測量病原菌的菌落半徑，計算抑制率，計算公式為：

抑制率=(對照病原菌的菌落半徑-對峙病原菌的菌落半徑)/對照病原菌的菌落半徑×100%

1.3 毛殼菌發(fā)酵粗提物的提取

1.3.1 培養(yǎng)基配制

一級培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯200 g，去皮切成小塊，在1 000 mL的蒸餾水中煮沸20 min，用紗布濾去殘渣，在濾液中加入20 g葡萄糖，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，1.5 g酵母膏，用NaOH調pH至5.8～6.0。

二級培養(yǎng)基：在大米中加入0.3%的蛋白胨并混合均勻，115 ℃滅菌 30 min。

1.3.2 毛殼菌的發(fā)酵

無菌條件下將生防毛殼菌接種到無菌的一級培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩恒溫培養(yǎng)3 d，轉速為140 r·min-1，得到一級種子。將一級種子按10%的接種量均勻接種到無菌的二級培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)25 d。

1.3.3 毛殼菌粗提物的提取

室溫下，用等體積的乙酸乙酯萃取二級培養(yǎng)后的毛殼菌3次，合并乙酸乙酯相，用旋轉蒸發(fā)儀于45 ℃濃縮蒸干，得淡黃色浸膏，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，得到濃度為1 g·L-1的濃縮液。

1.4 毛殼菌發(fā)酵粗提物抑菌試驗

將1.3.3中的粗提物濃縮液用DMSO配置成200 μg·mL-1的稀釋液[12]，以DMSO為陰性對照，以30 mg·mL-1的60%的多菌靈溶液為陽性對照。在無菌條件下，將靶標菌的菌餅接種在PDA平板中央，在距靶標菌3.5 cm處分別用直徑為7 mm的無菌打孔器打4個孔，孔中分別兩兩注入200 μg·mL-1的生防毛殼菌發(fā)酵粗提物的稀釋液、陰性對照液或陽性對照液各150 μL，采用菌落生長速率法測定各處理對病原菌的抑制率。

1.5 溫室盆栽防效試驗

1.5.1 無菌土的制備

將試驗土和砂過3 mm篩后按1∶1比例混勻，置于170 ℃干燥箱中恒溫干熱滅菌3次，每次滅菌3 h；花盆規(guī)格為9 cm×9 cm，每個花盆裝滅菌土300 g。

1.5.2 生防菌的接種及防效測定

取直徑為7 mm活化的毛殼菌菌餅置于PDB液體培養(yǎng)基中[13]，28 ℃振蕩培養(yǎng)5～7 d，轉速160 r·min-1；取預先催芽并露白的藏青320種子在100 mL的毛殼菌培養(yǎng)液中浸泡12 h，晾干，用PDB培養(yǎng)液浸種作為陰性對照，30 mg·mL-1的60%的多菌靈溶液浸種作為陽性對照[14]。將活化的青稞全蝕病菌和根腐病菌打成直徑為1 cm 的菌餅，放在裝有滅菌砂土的花盆中，每個花盆中放入10片菌餅。將青稞種子的根端朝下置于菌餅上，每片菌餅上放1粒青稞種子，最后用砂土(厚度約0.5 cm)覆蓋。在人工氣候箱中22 ℃保濕培養(yǎng)10 d，記載發(fā)病率、病情指數(shù)和防效。青稞全蝕病和根腐病的分級標準同孫炳劍等[15]方法：

發(fā)病率=發(fā)病的株數(shù)/調查的總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級病根數(shù)×該病級值)/(調查總根數(shù)×最高級值)×100

防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.6 毛殼菌的鑒定

1.6.1 毛殼菌的形態(tài)學鑒定

對生防效果較好的毛殼菌進行鑒定，形態(tài)學鑒定以Arx 等[16]方法為主要基礎和依據(jù)。將毛殼菌菌株接種到玉米粉培養(yǎng)基(CMA)平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)并定期觀察，待子囊果成熟時，在Nikon體式解剖鏡下用解剖針挑取單個子囊果，制成水玻片，通過萊卡(Leica)顯微鏡DM5000觀察子囊果的顏色和形態(tài)、附屬絲的形態(tài)、子囊的顏色和形態(tài)、子囊孢子的大小、顏色、萌發(fā)孔位置等特征并進行拍照，結合菌株在CMA培養(yǎng)基上的菌落特征，記錄子囊果的成熟時間，結合子囊果、附屬絲、子囊和子囊孢子的特征進行鑒定。每個菌株鑒定的個體數(shù)量不少于20個。

1.6.2 毛殼菌的分子鑒定

生防毛殼菌基因組DNA的提取參考甘麗萍等[17]的方法，并略有改進。用真菌核糖體基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)通用引物ITS-1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，(上海美吉生物科技有限公司合成)對菌株的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μL： 10×PCR緩沖液2.5 μL，DNA模板為15 ng，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，用雙蒸水將反應體系補足至25 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物的純化及序列測定由上海美吉生物科技有限公司完成，在GenBank中利用Blast進行同源序列查找，選擇24個相關種的rDNA-ITS核苷酸序列，使用CLUSTALX軟件進行對排，用MEGA 5.10在重復1 000次下構建系統(tǒng)發(fā)育樹(選擇Farrowialongicollea為外群)。

2 結果與分析

2.1 皿內(nèi)拮抗試驗結果

從表1可以看出，毛殼菌41-4在青稞根腐病和青稞全蝕病菌培養(yǎng)第3天時表現(xiàn)出抑菌效果，隨著培養(yǎng)時間的延長，抑菌效果逐漸穩(wěn)定，在第7～9天時抑菌率顯著提高，對青稞根腐病的抑菌率達到60.00%，對青稞全蝕病的抑菌率達到44.44%。毛殼菌LZT0016在青稞根腐病菌培養(yǎng)第3天時抑菌率最高(35%)，對青稞全蝕病的抑菌效果隨著時間的延長逐漸增強，但最高只達到24.44%。毛殼菌39-6-2和Z24-12在青稞根腐病培養(yǎng)第3天時沒有抑菌效果，反而表現(xiàn)出促進病原菌生長的情況，隨著培養(yǎng)時間的延長對青稞根腐病表現(xiàn)一定抑菌效果，抑菌率最高分別為22.22%和31.11%；對青稞全蝕病的抑菌率隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸增大，最高抑菌率為33.33%和12.20%。同時，從圖1可以看出，毛殼菌41-4與青稞根腐病菌和青稞全蝕病菌對峙培養(yǎng)時，均形成明顯抑菌帶，對兩種病原菌的抑菌帶寬度均達到1.4 cm。

表1 4株毛殼菌對青稞根腐病菌和全蝕病菌的抑菌率Table 1 Inhibition rate of four strains of Chaetomium spp. on root rot and take-all disease in hulless barley %

同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示0.05水平差異顯著。下同。

Different letters following values indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

A：全蝕病菌；B：根腐病菌；C：毛殼菌41-4。

A:Take-all; B:Root rot; C:Chaetomiumspp. 41-4.

圖1毛殼菌41-4對青稞根腐病和青稞全蝕病的抑菌效果

Fig.1InhibitioneffectofChaetomiumspp.41-4onrootrotdiseaseandtake-alldiseaseinhullessbarley

2.2 毛殼菌發(fā)酵粗提物的抑菌效果

從表2可知，毛殼菌41-4的發(fā)酵粗提物對青稞根腐病和青稞全蝕病有較好的抑菌效果，培養(yǎng)7 d時的抑菌率分別達到64.44%和60.00%，與陽性對照30 mg·mL-1的60%多菌靈抑菌效果相當。毛殼菌LZT0016對兩種病原菌也有抑菌作用，但抑菌率隨培養(yǎng)時間推移持續(xù)下降，在病原菌培養(yǎng)第7天時，抑菌率僅為10.00%；毛殼菌39-6-2和Z24-12對兩種青稞病原菌在培養(yǎng)第7天時沒有抑菌效果。從圖2可以看出，毛殼菌41-4的發(fā)酵粗提物對兩種青稞病原菌均形成明顯的抑菌帶，抑菌帶寬度均達1.5 cm。

表2 4株毛殼菌發(fā)酵粗提物對青稞根腐病菌和青稞全蝕病菌的抑菌率Table 2 Inhibition rate of four strains of crude extract of Chaetomium spp. on root rot and take-all disease in hulless barley %

A：毛殼菌41-4發(fā)酵粗提物；B：陽性對照；C：陰性對照。左圖為全蝕病菌，右圖為根腐病菌。

A:Crude fermentation extract fromChaetomiumspp. 41-4; B:Positive CK; C:Negative CK；Left is take-all,and right is root rot.

圖2毛殼菌41-4發(fā)酵粗提物對青稞根腐病菌和青稞全蝕病菌的抑菌效果

Fig.2 Antibacterial effect of crude fermentation extract from Chaetomium spp.41-4 on root rot and take-all disease in hulless bartey

2.3 毛殼菌的盆栽防效

從表3可以看出，毛殼菌41-4在降低青稞根腐病和青稞全蝕病的發(fā)病率上沒有明顯作用，但兩種病害的發(fā)病嚴重度均降低，病情指數(shù)明顯下降，表現(xiàn)出較好的防效，其防效僅次于30 mg·mL-1的60%多菌靈，其他3株毛殼菌在降低發(fā)病率和病性指數(shù)上也有一定作用，對兩種青稞病害的防效較低。

表3 4株毛殼菌對青稞根腐病和青稞全蝕病的盆栽防效Table 3 Potted control effect of four strains of Chaetomium spp. on root rot and take-all disease in hulless barley

2.4 毛殼菌的形態(tài)鑒定結果

菌株41-4具有以下特點：菌落淺色，日平均生長速率7～8 mm，氣生菌絲淺色，苔蘚狀，致密，有淺橙色分泌物溢出；子囊果表生，球形至卵圓形，子囊果直徑165～245×239～282 μm，有固定孔口，子囊果7 d開始成熟，子囊果果壁在反射光下呈橄欖褐色或灰褐色；果壁細胞多邊形狀或不規(guī)則形，有棱角，4～5 μm；附屬絲發(fā)達，周生，直或略彎曲成波浪狀，褐色，具疣，具隔，基部寬約3～4.5 μm，長度可達500 μm；子囊棍棒狀，具柄，簇生，內(nèi)含8個子囊孢子，容易消解，含柄部分50～80×30～40×10～15 μm；子囊孢子褐色，檸檬形，厚壁，兩側平滑，兩端略突起，7.5～8.5×9.2～10.2 μm，有1個頂生萌發(fā)孔(圖3)。根據(jù)形態(tài)學特征將菌株41-4鑒定為球毛殼菌Chaetomiumglobosum。該毛殼菌為土壤分離物，采集地為西藏林芝市排龍鄉(xiāng)帕龍藏布河溝，海拔2 000 m，地理位置為N:30°01′，E:95°01′。

2.5 毛殼菌的分子鑒定結果

對毛殼菌41-4進行基因組DNA的提取，采用真菌通用引物ITS-1F和ITS4進行擴增后得到長度約為600 bp的目標片段，測序獲得了567 bp核苷酸序列，將測定的序列提交GenBank(登錄號：KY132166)，通過選擇24個相關種的rDNA-ITS序列進行同源性比對，用MEGA5.10軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖4可以看出，毛殼菌41-4與Chaetomiumglobosum(FN868476、KJ863531)等在99%相似水平上聚為一類，從分子水平上驗證了毛殼菌41-4與球毛殼菌Chaetomiumglobosum的親緣關系最近。

A：菌落；B：子囊果； C：子囊； D：子囊孢子 (比例尺：B=15 μm；C，D=30 μm)。

A:Colony; B:Ascomata; C:Asci; D:Ascospores(Scale bars:B = 15 μm; C,D = 30 μm).

圖3毛殼菌41-4的形態(tài)特征

Fig.3MorphologicalcharacteristicsofChaetomiumspp.41-4

3 討 論

在皿內(nèi)拮抗試驗中，病原菌培養(yǎng)3 d時，毛殼菌39-6-2和Z24-12不但沒有抑菌作用反而表現(xiàn)出一定的促生長作用，推測這兩種毛殼菌分泌物中含有促青稞全蝕病和根腐病菌生長的因子，當培養(yǎng)至第7天至第9天時，4株毛殼菌生長成熟，此時產(chǎn)生的抗菌物質的量較大，對病原菌生長表現(xiàn)出抑制作用，毛殼菌41-4的抑菌作用最好。

在毛殼菌發(fā)酵粗提物的抑菌試驗中，39-6-2對供試病原菌無抑菌作用，毛殼菌Z24-12和LZT0016在根腐病菌生長至第3天時表現(xiàn)出較好的抑菌性，隨著培養(yǎng)時間的延長，抑菌能力逐漸減弱甚至消失，可能與這兩株毛殼菌活性物質的穩(wěn)定性有關，毛殼菌41-4在該試驗中表現(xiàn)出穩(wěn)定而明顯的抑菌效果。

括號中為相關菌株在GenBank 登記號，分支處數(shù)值表示自舉值。尺標表示每個核苷酸位點上的0.1替換值。

Numbers in parentheses represent the accession numbers of the related isolates in GenBank,The numbers in each branch points denote the percentage supported by bootstrap. Scale bar represents 0.1 substitutions per nucleotide position.

圖4基于rDNA-ITS序列構建的毛殼菌41-4的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.4PhylogenetictreeofChaetomiumspp.41-4constructedbasedonrDNA-ITSsequences

在盆栽防效試驗中，4株毛殼菌對降低兩種青稞病害發(fā)病率的作用均不明顯，毛殼菌41-4對兩種病害的病情指數(shù)和防效具有較好降低效果，在生產(chǎn)中可將該菌開發(fā)為種子包衣劑，用于病害的預防，或者開發(fā)相關生物肥料，用于青稞根部病害的預防。

國內(nèi)外學者對毛殼菌的生物防治進行了系列研究，發(fā)現(xiàn)毛殼菌能夠產(chǎn)生大量化學物質，不僅起到刺激植物生長的作用，而且還有助于改善土壤肥力，從而促進植物的生長并提高作物的產(chǎn)量。毛殼菌所產(chǎn)生的代謝物質，還能夠誘導植物某些組織抗氧化能力的增強，從而提高植物的抗病能力[18]。施加毛殼菌菌肥能促進黃瓜生長，提高其產(chǎn)量，并改善其品質及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境[19]。宋富海等研究表明，球毛殼菌肥可提高土壤酶活性[20]，叢國強等[21]研究表明，球毛殼菌促進小麥根系發(fā)育和植株生長并影響小麥的抗旱性。夏宣宣等[22]將球毛殼菌作為菌肥，發(fā)現(xiàn)其能在一定程度上提高楊樹的根系生理活性，提高楊樹葉片對光能的利用效率，有利于改善楊樹葉片的光合機構運轉狀態(tài)，提高葉片的光合作用效率。印 容等[23]研究表明，球毛殼菌對油菜根腫病的防效為76.88%。本試驗篩選的球毛殼菌41-4來源于西藏，對西藏主要的糧食作物青稞的兩種根部病害具有較好的生防效果，該菌株可以開發(fā)成菌肥用于西藏的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可提高植物抗性，減少化學農(nóng)藥的使用，對西藏的無公害生產(chǎn)和保護西藏的原生態(tài)具有重要意義。本研究中球毛殼菌41-4的發(fā)酵粗提物具有明顯的抑菌效果，具體是哪些物質成分在發(fā)揮重要作用，還需要做進一步的研究。

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ScreeningandIdentificationofBiologicalControlChaetomiumofRootRotandTake-allDiseaseinHullessBarley

YUEHaimei1，2,ZHUANGHua2,GONGWenfeng1,ZHANGXinjun3

(1.Department of Plant Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi，Tibet 860000，China；2.College of Plant Protection，Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas，Yangling，Shaanxi 712100，China； 3.Tibet Plateau Institute of Ecology，Linzhi，Tibet 860000，China)

The root rot and take-all disease in hulless barley are common rot diseases in Tibet highland. To screen out of suitableChaetomiumspp. for controlling root rot and take-all disease in hulless barley,four strains ofChaetomiumspp. were selected,and the strains with strong antibacterial activity were screened by the antagonistic test,the crude extract of the fermentation and the pot experiment. The high activity strain was identified by morphological and molecular biology methods. In the dish antagonistic experiment,Chaetomium41-4 presented stable and obvious inhibitory effect on root rot and take-all disease in hulless barley during 7 to 9 culture days,with the inhibition rate of 60% and 44.44%,respectively,and the extent of inhibition zone reached to 1.4 cm; in fermentation extracts antibacterial experiment,the performance ofChaetomium41-4 exhibited stable antibacterial effect on root rot and take-all disease at 7th culture day,with the inhibition rate of 64.44% and 60.00%,respectively,and the extent of inhibition zone reached to 1.5 cm; in the greenhouse control effect experiment,Chaetomium41-4 play a control effect in reducing the incidence of severity and disease index for root rot and take-all disease,with the control effect rate of 62.67% and 39.45%,respectively.Chaetomium41-4 has been screened to have better biological control effect,and this strain has also been identified asC.globosumaccording to its morphological characteristics,rDNA internal transcribed spacer(rDNA-ITS) sequence and phylogenetic analysis. The biocontrol strains could be available in the development of microbial fertilizer,which is important to pollution-free agricultural production and ecological protection in Tibet.

Barley root rot; Barley take-all disease;Chaetomiumspp.; Screening; Identification

時間：2017-10-11

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171011.1602.032.html

2017-03-14

2017-04-08

國家自然科學基金項目(31360006); 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室開放基金項目(CSBAA2016006)；作物學科建設項目(2015ZWXKJS，2016ZWXKJS)

E-mail：yuehm1980@163.com

S512.3；S432.4

A

1009-1041(2017)10-1390-08