通脈散瘀凝膠提取物平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

劉曉燕 馬海玲 張?jiān)伱?余 暉 巫靜華

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院江蘇省企業(yè)研究生工作站，張家港，215600)

通脈散瘀凝膠提取物平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

劉曉燕 馬海玲 張?jiān)伱?余 暉 巫靜華

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院江蘇省企業(yè)研究生工作站，張家港，215600)

目的：測(cè)定通脈散瘀凝膠提取物及指標(biāo)成分在不同溶劑中的平衡溶解度及不同pH下的表觀油水分配系數(shù)，探索通脈散瘀凝膠提取物的溶解性能。方法：采用沉淀法測(cè)定提取物的溶解度，以指標(biāo)成分法測(cè)定提取物在不同溶劑中的平衡溶解度以及在正辛醇/水和正辛醇/緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果：37 ℃時(shí)提取物在乙醇中的平衡溶解度較大，在緩沖液中呈先減小后增大趨勢(shì)；以指標(biāo)成分來(lái)看，丹酚酸B和丹參素在pH緩沖液中溶解度先減小后增大，丹參酮ⅡA和隱丹參酮在pH 9時(shí)平衡溶解度達(dá)到最大；丹酚酸B和丹參素的油水分配系數(shù)隨pH增大而減小，丹參酮ⅡA和隱丹參酮在pH8時(shí)lgP達(dá)到最大。結(jié)論：通脈散瘀提取物在醇類(lèi)中的溶解度較大，可考慮在處方中加入適量乙醇提高溶解度；pH影響提取物的油水分配系數(shù)，可通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)促進(jìn)其經(jīng)皮吸收。

平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；通脈散瘀提取物

通脈散瘀凝膠處方來(lái)自臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、紅花、川芎等6味藥組成。具有通脈止痛、活血消腫等功效。我們?cè)谥嗅t(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用現(xiàn)代科技手段將其制成服用攜帶方便、質(zhì)量可控、藥理作用明確、臨床療效確切的外用凝膠劑。處方提取物中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素是君藥中發(fā)揮療效的主要藥效成分[1-2]，本實(shí)驗(yàn)以4個(gè)指標(biāo)成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)綜合評(píng)價(jià)提取物的溶解性能及理化性質(zhì)，以期為通脈散瘀凝膠經(jīng)皮給藥新劑型提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站；色譜柱為Waters XBridge柱；AG135型電子天平(瑞士梅特勒公司)；FA1104N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AS20500A超聲清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PHS-3型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)股份有限公司)

1.2 試劑 丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-201520)、隱丹參酮(批號(hào)：110852-200806)、丹酚酸B(批號(hào)：111562-201313)、丹參素(批號(hào)：110855-201412)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(汕頭市西隴化工廠有限公司)；正辛醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；通脈散瘀提取物(由張家港市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號(hào)：20150907)；甲醇(色譜純，山東禹王試劑有限公司)、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)，水為雙蒸水，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿均為分析純

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素含量測(cè)定方法的建立[3-6]

2.1.1 色譜條件 Waters XBridge色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫：0～8 min，8%～18%A；8～15 min，18%～21%A；15～20 min，21%～30%A；20～25 min，30%～40%A；25～45 min，40%～75%A；45～60 min，75%A，體積流量為1 mL/min，進(jìn)樣10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配置 精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素對(duì)照品適量，加75%甲醇制成每1 mL含丹參酮ⅡA0.05 mg、隱丹參酮0.053 mg、丹酚酸B0.066 mg、丹參素0.064 mg的混標(biāo)溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取提取物0.1 g，置10 mL容量瓶中，加75%甲醇超聲溶解，定容至刻度，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺丹參的通脈散瘀提取物，精密稱(chēng)取0.1 g，置10 mL容量瓶中，加75%甲醇超聲溶解，定容至刻度，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密吸取混合對(duì)照品適量，加75%甲醇稀釋制成系列對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸處理，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍

2.1.6 專(zhuān)屬性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜方法測(cè)定。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2 平衡溶解度的測(cè)定[7-8]

2.2.1 重量法 取通脈散瘀提取物約1 g，精密稱(chēng)定，置于西林瓶中，加入10 mL不同溶劑，始終保持有固體物存在，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中振搖24 h，溫度保持37 ℃，使其達(dá)到充分溶解。將西林瓶中的藥液連同殘留的固體藥物一同轉(zhuǎn)移至已經(jīng)恒定質(zhì)量的離心管中，4000 r/min離心10 min，傾出上清液，底部殘?jiān)B同離心管在70 ℃烘干至恒重，稱(chēng)定重量，計(jì)算提取物在不同溶劑中的平衡溶解度。平衡溶解度=(m加入量-m未溶解量)/V溶劑體積。選擇的溶劑有水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷，pH分別為3.11、3.94、4.99、6.71、7.46、8.02、8.95、10.18的緩沖液。提取物在水及有機(jī)溶劑中的溶解度見(jiàn)圖1，在緩沖液中的溶解度見(jiàn)圖2。由圖1可知提取物在乙醇中的平衡溶解度較好，水和丙酮中次之；在緩沖液中隨pH值增加平衡溶解度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。

圖1 提取物在37 ℃不同溶劑中的平衡溶解度

圖2 提取物在37 ℃不同pH緩沖液中的平衡溶解度

2.2.2 指標(biāo)成分法[9-10]取2.2.1項(xiàng)下所得上清液5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋搖勻定容至刻度。12 000 r/min離心，上清液照2.1.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素在不同溶劑中的平衡溶解度。4個(gè)指標(biāo)成分在有機(jī)溶劑中的溶解度見(jiàn)表1，在不同緩沖液中的平衡溶解度見(jiàn)圖3，圖4。結(jié)果顯示，37 ℃時(shí)丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B及丹參素在甲醇中的溶解度最大；在緩沖體系中丹酚酸B及丹參素的溶解度受pH影響較大，丹參酮ⅡA及隱丹參酮的溶解度變化較小。

2.3 表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定[11-12]稱(chēng)取通脈散瘀提取物適量，至10 mL容量瓶中，分別加入被正辛醇飽和的水和不同pH值的PBS緩沖液超聲30 min，使其充分溶解，用相同溶劑定容至刻度，保證一直有固體藥物存在，使其呈飽和狀態(tài)，靜止后離心(5 000 r/min，10 min)，取上清液2 mL，氮?dú)獯蹈?，?5%甲醇5 mL，渦旋5 min，離心(5 000 r/min，10 min)取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，測(cè)定其中指標(biāo)成分的濃度為C0，再取上清液5 mL至具塞錐形瓶中，分別加入5 mL被水飽和過(guò)的正辛醇溶液，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37 ℃，振搖24 h，靜止后取上層油相2 mL，氮?dú)獯蹈?，?5%甲醇5 mL，渦旋5 min，離心(5 000 r/min，10 min)取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，測(cè)定其中指標(biāo)成分的濃度為C1。按照公式計(jì)算表觀油水分配系數(shù)(P)，計(jì)算公式如下：P=C1V1/(C0V0-C1V1)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。丹酚酸B和丹參素的油水分配系數(shù)在pH值8以后趨于平緩，而丹參酮ⅡA和隱丹參酮的油水分配系數(shù)成鋸齒狀變化。

表2 丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素在37 ℃不同有機(jī)溶劑中的溶解度

圖3 丹酚酸B和丹參素在不同pH緩沖液中的平衡溶解度

圖4 丹參酮ⅡA和隱丹參酮在不同pH緩沖液中的 平衡溶解度

圖5 丹酚酸B和丹參素在37 ℃下不同 pH的緩沖液中的lgP值

圖6 丹參酮ⅡA和隱丹參酮在37 ℃下不同 pH的緩沖液中的lgP值

3 討論

中藥提取物含多個(gè)及多種性質(zhì)不同的化合物，這些化合物之間存在增溶、助溶、競(jìng)爭(zhēng)性抑制等相互作用，因此中藥提取物的溶解過(guò)程極其復(fù)雜。溶解是吸收的前提，藥物的溶解度是影響藥物吸收分布的重要因素之一。表觀油水分配系數(shù)是影響藥物經(jīng)皮吸收的重要因素，是藥物傳遞系統(tǒng)中的重要參數(shù)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合重量法和搖瓶法，同時(shí)測(cè)定了通脈散瘀提取物及指標(biāo)成分的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)，能較好地反映提取物的溶解性能。

采用重量法考察提取物在不同溶劑及不同pH緩沖液中的平衡溶解度，由圖1可以看出，提取物在乙醇和水中的溶解度較大，表明提取物在偏極性的溶劑中溶解較好，提示在設(shè)計(jì)凝膠處方時(shí)適當(dāng)加入乙醇可提高其溶解度。圖2表明提取物在pH 3.11～6.71范圍內(nèi)溶解度逐漸減小，而在pH 6.71～10.18范圍內(nèi)溶解度逐漸增加，說(shuō)明pH對(duì)藥物溶解度有較大影響，在劑型設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮pH值不同給藥物溶解度帶來(lái)的影響。

提取物中丹參素和丹酚酸B在不同pH緩沖液中的溶解度均呈現(xiàn)隨pH值增加先減小后增大的趨勢(shì)。丹參素是β-3,4-二羥基苯乳酸，丹酚酸B是由3分子丹參素與1分子咖啡酸縮合而成，二者均是多酚基化合物。在酸性條件下，丹參素和丹酚酸B均以原型存在，其水溶性較好，溶解度較高，在中性環(huán)境下溶解度較低。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]稱(chēng)丹參素在pH6.8的緩沖液體系中可能分解為其他物質(zhì)，具體原因待進(jìn)一步探討。隨著pH值增加，二者溶解度逐漸增大。有文獻(xiàn)指出，丹酚酸類(lèi)成分在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，易分解及轉(zhuǎn)化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有出入，原因可能是組方中的其他化學(xué)成分對(duì)丹酚酸類(lèi)成分起到了穩(wěn)定作用，下一步需進(jìn)行全面仔細(xì)的組方分析，這同時(shí)也從另一方面反映了通脈散瘀組方的合理性。丹參素和丹酚酸B的水溶性良好，這也導(dǎo)致其脂溶性較弱。由圖5可以看出，在由正辛醇和緩沖液組成的油水分配系統(tǒng)中，二者的lgP值均較低，范圍為-3.59時(shí)溶解度又逐漸上升呈平穩(wěn)趨勢(shì)，而二者的油水分配系數(shù)則呈鋸齒狀變化。丹參酮ⅡA和隱丹參酮單體化合物脂溶性較強(qiáng)，但由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6可以看出，二者的lgP值在-1到0之間，而文獻(xiàn)報(bào)道[15]藥物吸收的最佳范圍是-1

由平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果可知，通脈散瘀提取物及指標(biāo)成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)受pH值影響較大，部分指標(biāo)的滲透性較差，故在處方設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意調(diào)節(jié)pH值及添加合適的吸收促進(jìn)劑，以提高通脈散瘀處方的透皮吸收效果。

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TheDeterminationofEquilibriumSolubilityandApparentOil-waterPartitionCoefficientonTongmaisanyuExtract

Liu Xiaoyan，Ma Hailing，Zhang Yongmei，Yu Hui，Wu Jinghua

(ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhangjiagang215600，China)

Objective:To determine Tongmaisanyu gel extract and index components in different solvents′ equilibrium solubility and apparent partition coefficient in different pH to explore the solvent performance of Tongmaisanyu extract.MethodsTaking the precipitation method for the determination of the solubility of the extract and equilibrium solubility of index components in different solvents as well as partition coefficient in n-octanol / water and n-octanol / buffer.ResultsThe equilibrium solubility of the extract in ethanol was higher at 37 ℃, and it decreased first and then increased in buffer; the solubility of salvianolic acid B and danshensu in pH buffer decreased first and then increased, and the equilibrium solubility of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone was the highest at pH 9; the oil-water partition coefficient of salvianolic acid B and danshensu decreased with the increase of pH, and the lgP of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone reached the maximum at pH8.ConclusionTongmaisanyu extract dissolves greater in alcohols, so adding an appropriate amount of ethanol in the formulation to increase the solubility may be favorable. And pH can affect the partition coefficient, so for percutaneous absorption may be promoted by adjusting the pH values.

Equilibrium; Oil-water partition coefficient; Tongmaisanyu extract

蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(SYSD2015165)

劉曉燕(1983.06—)，女，本科，主管中藥師，研究方向:中藥新制劑與新劑型，E-mail：467531548@qq.com

R284

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.048

(2016-07-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))